Open Access

Kirsten Dörries

• The metabolomic approach is one part of the "-omics" cascade further comprising genomic, transcriptomic, and proteomic investigations. Since information about the metabolome of the important human pathogenic bacterium Staphylococcus aureus is scarce, the aim of this thesis is the characterization of the exo- and endometabolome of this bacterium on a most global scale. For this, the metabolomic platform consisting of the analytical instruments used for 1H-NMR spectroscopy, HPLC-MS, and GC-MS analysis was applied. First, the requirements for an accurate sampling procedure for the analysis of intracellular metabolites are presented, explaining important pitfalls during the sampling and the subsequent metabolome analysis via HPLC-MS and GC-MS (book chapter I). The challenging task of the metabolite identification is demonstrated, as well as the requirements for absolute quantification of intracellular metabolites. In order to enhance the knowledge about the staphylococcal physiology and the biochemical network, the impact of different stresses and varying cultivation media on the bacterial metabolite pool was investigated in several studies. In article I, a first description of the primary metabolism of growing S. aureus COL cells cultivated aerobically in CDM is provided. This study also monitored the adaptation to glucose starvation on the level of metabolites and proteins. The uptake of all amino acids and the secretion and reuse of overflow metabolites were analyzed in a time-dependent manner. During the switch to a non-growing state, a drastic rearrangement of the amino acid pool in the bacterial cells was detected, and intracellular amounts of glycolytic intermediates were found to decrease in parallel to extracellular glucose exhaustion. During infection processes, S. aureus has to cope with varying levels of oxygen supply, including anaerobic conditions. A global metabolomic approach investigated the adaptation of S. aureus COL to strict anaerobic conditions using CDM as the culture medium. Thereby only linear growth was possible despite the higher uptake rate of glucose compared to aerobically, logarithmically growing cells. In an anoxic environment, S. aureus mainly switched on the less reliable lactic acid fermentation. Only serine and threonine but no alanine were significantly taken up. Subsequent glucose limitation led to energy starvation indicated by a drop in the adenylate energy charge. This was accompanied with an arrest of the fermentative metabolism and declining numbers of colony-forming units without taking advantage of the energy supplying arginine deiminase pathway. Compared to the established CDM, the eukaryotic cell culture medium RPMI 1640 provides more in vivo-like growth conditions. In article II, the growth behavior and the metabolic footprint of the S. aureus strains COL and HG001 were investigated during the aerobic cultivation in RPMI 1640 medium. Both strains are commonly used in laboratory research. The observed uptake and secretion pattern of extracellular metabolites provides important information for infection studies in which this medium is used for the precultivation of S. aureus. The extracellular accumulation of the noncanonical D-amino acid D-isoleucine was an interesting outcome. The strain specific metabolic footprint points to noteworthy differences in the biochemical system of both strains. Moreover, this study demonstrates the impact of the cultivation medium on the metabolic status of bacterial cells. Due to increasing resistance against a large number of antibiotics, community- and hospital- acquired infections with S. aureus are of major concern in medical therapy. Thus, greater knowledge about adaptive mechanisms after antibiotic treatment is required. In article III, the response of S. aureus HG001 to antibiotics with varying target sides, such as ciprofloxacin, erythromycin, fosfomycin, vancomycin, and ampicillin, was investigated on the metabolite level. Thereby, the abundances of 176 intracellular metabolites were observed in a time-dependent manner, thus providing the most comprehensive experimental metabolite dataset so far available for S. aureus. None of the antibiotic compounds led to alterations of single metabolite amounts, but mostly entire metabolic pathways were affected. The intermediates of the cell wall biosynthesis were affected by each antibiotic, confirming this pathway as the most potential target for new antibacterial compounds. The metabolite composition of human nasal secretions and human sweat was analyzed, since such secretions present natural habitats of S. aureus during the colonization of typical host sides. The results confirm that the bacteria has to cope with low concentrations of most of the amino acids but large amounts of urea and lactate during host colonization. Considering the supply of amino acids, the results support the usage of the RPMI 1640 medium as a step to more in vivo-like cultivation experiments. Moreover, essential information for future studies about the adaptation of S. aureus to more in vivo growth conditions is provided. Altogether, the metabolomic approach was proven to be an important tool for helping unravel the complex bacterial metabolism and the environmental factors that also play a role in the virulence of Staphylococcus aureus.
• Das Forschungsfeld "Metabolomics" ist Teil der gesamten -omics Technologien, wie auch Genomics, Transkriptomics und Proteomics, und bearbeitet die Analyse von extra- und intra-zellulären Stoffwechselprodukten eines biologischen Systems. Für das humanpathogene Bakterium Staphylococcus aureus wurden bisher kaum Metabolomdaten erhoben. Daher ist das Ziel dieser Dissertation eine umfassende Charakterisierung des Exo- und Endometaboloms von S. aureus. Dafür wurde die Metabolomics-Messplattform, bestehend aus einem 1H-NMR-Spekrometer, einer HPLC-MS- und einer GC-MS-Anlage, genutzt. Für die Metaboliten-Analyse, besonders die der intrazellulären Metabolite, ist ein optimales Probenahme-Protokoll unerlässlich, da dieses ein besonders schnelles und effektives Quenchen des Metabolismus des zu untersuchenden Organismus gewährleisten muss. In dieser Arbeit werden die wichtigsten zu beachtenden Punkte während der Probenahme und der anschließenden Analyse mit den verschiedenen Instrumenten vorgestellt (Buchkapitel I). Zudem werden kritische Schritte in der Datenanalyse, wie die sichere Identi-fizierung von Signalen und die absolute Quantifizierung von intrazellulären Metaboliten erläutert. Mithilfe des optimalen Protokolls wurde eine erste umfassende Metabolom-Analyse entlang einer Wachstumskurve von S. aureus COL unter aeroben Bedingungen in CDM durchgeführt (Artikel I). Diese Analyse schließt sowohl die logarithmisch wachsenden also auch die durch Glukose-Mangel im Wachstum gestoppten S. aureus Zellen ein. Dabei wurde erstmalig die mengenmäßige Verteilung der Metabolite des Primärstoffwechsels beschrieben, sowie ihre dynamischen Veränderungen im zeitlichen Verlauf des Experiments. Die detektierte Aufnahme der im Medium verfügbaren Glukose und Aminosäuren, sowie die Sekretion von Overflow-Metaboliten und Intermediaten des Citratzyklus liefern wichtige Informationen über die metabolische Aktivität von S. aureus. Besonders interessant ist dabei die Konzentrationsabnahme der intrazellulären glykolytischen Intermediate parallel zu der sinkenden extrazellulären Glukose-Konzentration. Im Aminosäure-Pool wurden die mengenmäßig stärksten Konzentrationsänderungen in Glukose-hungernden S. aureus Zellen nachgewiesen. Während einer Infektion im menschlichen Körper, ist S. aureus in Abhängigkeit von der Entfernung des infizierten Gewebes zu den Kapillaren unterschiedlichen Sauerstoff-Partialdrücken ausgesetzt. Für die Untersuchung der Adaptation an fermentative Bedingungen, unter Nutzung des CDM als Kultivierungsmedium, wurden aerob wachsende S. aureus COL Zellen in eine strikt anaerobe Umgebung ohne alternative Elektronenakzeptoren umgesetzt. Ein schnelles Anschalten des Fermentationsstoffwechsels ermöglichte lineares Wachstum, wobei Glukose mit einer höheren Rate aufgenommen wurde als unter aeroben Bedingungen. Obwohl Proteomdaten eine starke Induktion der Proteine für die Laktat- und die gemischte Säure-Gärung zeigen, konnte auf Metabolom-Ebene eine deutlich dominierende Laktat-Gärung nachgewiesen werden. Aminosäuren wurden nur begrenzt verwertet. Mit zusätzlich eintretender Glukose-Limitation war keine Aufrechterhaltung des Energiestoffwechsels mehr möglich, da Arginin als alternative Energiequelle nicht ausreichend genutzt wurde. Um das Wachstumsverhalten und den Nährstoff-Verbrauch von S. aureus in einer Umgebung ähnlich der im Wirt zu untersuchen, wurden die beiden S. aureus Stämme COL und HG001 in einem eukaryotischen Zellkulturmedium kultiviert (Artikel II). Entlang der aeroben Wachstumskurve wurden die metabolischen Footprints beider Stämme analysiert, wobei unterschiedliche Aufnahme- und Sekretionsmuster nachgewiesen wurden, die zu einer statistische Separation beider Stämme führte. Interessanterweise konnte D-Isoleucin im extrazellulären Überstand beider Stämme nachgewiesen werden, welches als seltene D-Aminosäure vermutlich regulatorische Funktion besitzt. Da dieses Medium auch für die Vorkultivierung von S. aureus für Infektionsversuche verwendet wird, liefert diese Studie wichtige Informationen über die ablaufenden Stoffwechselvorgänge unter diesen Bedingungen. Die zunehmende Verbreitung von multiresistenten S. aureus Stämmen zwingt zur Suche nach neuen antibiotisch wirksamen Substanzen und auch zu einem verbesserten Verständnis grund-legender physiologischer Vorgänge im Stoffwechsel von S. aureus. Im Zuge dessen wurde die Reaktion von S. aureus HG001 nach Stress mit Antibiotika unterschiedlicher Wirkmechanismen (Ciprofloxacin, Erythromycin, Fosfomycin, Vancomycin, Ampicillin) auf intra- und extrazellulärer Metaboliten-Ebene untersucht (Artikel III). Innerhalb von zwei Stunden nach antibiotischem Stress wurden die Verläufe von 176 intrazellulären Metaboliten analysiert, was die bislang umfassendste Metabolom-Studie von S. aureus darstellt. Dabei wurden keine Marker-Metabolite für jeden einzel-nen antibiotischen Stress nachgewiesen, vielmehr führte jedes Antibiotikum zu weitreichenden Veränderungen im gesamten Endometabolom. Am stärksten betroffen war dabei der Pool aus Zellwand-Vorstufen, was das Potential dieses Stoffwechselweges als Zielstruktur für neue effektive Antibiotika bestätigt. Bei der Besiedlung des menschlichen Körpers wird S. aureus vor allem auf der Nasenschleim-haut und auf der Haut von Armen nachgewiesen. Um erste Einblicke in die Nährstoffversorgung in diesen natürlichen Habitaten zu erlangen, wurden Metabolom-Analysen von menschlichem Nasen-schleim und Schweiß durchgeführt. Dabei wurden Aminosäuren in geringen Konzentrationen nach-gewiesen, jedoch für Laktat und Harnstoff sehr hohe Konzentrationen detektiert. Bezüglich der Aminosäure-Versorgung ähnelt das RPMI-Medium damit den Gegebenheiten während der Besied-lung des menschlichen Körpers. Für zukünftige Untersuchungen zur Physiologie von S. aureus kann die Verwendung von einem Kultivierungsmedium mit hohem Laktat- und Harnstoffgehalt wichtige Informationen zur Adaptation des Bakteriums an die Wirtsumgebung liefern. Insgesamt tragen die Ergebnisse der Metabolom-Studien zu einem besseren Verständnis der zellulären Vorgänge innerhalb des Bakteriums bei. Durch die Analyse von extrazellulären Nährstoffen können außerdem wichtige Faktoren ausfindig gemacht werden, die entscheidenden Einfluss auf den Stoffwechsel und auch auf die Virulenz von S. aureus haben.