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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-41371

Functional characterization of lipoproteins in Staphylococcus aureus

  • Lipoproteins of Staphylococcus aureus represent a major class of surface proteins, which are anchored to the outer leaflet of the cell membrane. Although they play a key role in the immune response and virulence, the majority of lipoproteins in this organism is still of unknown function. The aim of our study was to investigate the function of so far poorly or uncharacterized lipoproteins in S. aureus strain Newman. To this end, an integrated bioinformatical approach was applied to define the pan-lipoproteome of 123 completely sequenced S. aureus strains. In total, this analysis predicted 192 different potential lipoproteins, with a core lipoproteome of 39 and a variable lipoproteome of 153 lipoproteins. Out of those 192 lipoproteins, 141 are so far functionally uncharacterized. Primarily focusing on members of the core-lipoproteome with unknown or poorly characterized function, 24 lipoproteins or co-encoded neighbor proteins were selected for further characterization. Of those 24 proteins, 20 S. aureus markerless deletion mutants were constructed (S. aureus delta l01 - delta l20) and screened for an altered growth behavior under various conditions. Here, three mutants showed a temperature-sensitive phenotype, two mutants formed aggregates in the TSB of the manufacturer Merck (TSBMerck), and four mutants showed reduced growth under osmotic stress with 8% NaCl. An altered aggregation behavior was observed for four mutants in the presence of Triton X-100 and for eleven mutants in the presence of SDS. Furthermore, ten mutants revealed an impaired biofilm formation capacity as well as reduced hemolytic activity. Interestingly, S. aureus deletion mutants delta l14 (delta NWMN_1435) and delta l16 (delta NWMN_0646) showed an altered phenotype under nearly all tested growth and stress conditions. Most strikingly, both deletion mutants demonstrated dramatic defects in cell morphology and cell division during the transient growth phase in TSBMerck and were therefore selected for further detailed characterization. Electron microscopy imaging of the two mutants revealed an irregular cell shape, increased cell size, multiple displaced division septa, and incomplete separation of daughter cells resulting in the formation of cell aggregates in TSBMerck. Complementarily, microarray-based transcriptome analysis and whole-genome sequencing of S. aureus delta l14 and delta l16 suppressor mutants strongly point to a functional association of both lipoproteins with cell envelope- or cell division-related processes. Specifically, multiple hints suggest a functional connection of both lipoproteins with lipo- or wall teichoic acids. Of note, the phenotypes of S. aureus delta l14 and delta l16 are conditional and appear under some, but not all growth conditions. Thus, it is conceivable that the function of L14 and L16 is modulated by metabolic processes, or that the proteins might be part of a “backup system” becoming important only under certain conditions. Collectively, we propose that L14 and L16 fulfill a basic role in cell envelope- or cell division-related processes under specific growth conditions. Particularly, the activity of L14 and L16 might be necessary for the function or localization of lipo- or wall teichoic acids, and thus, might be linked to the regulation of autolysins. In conclusion, this study reveals important insights into the function of two so far uncharacterized but highly conserved lipoproteins in S. aureus.
  • Der humanpathogene Erreger Staphylococcus aureus weist eine Gruppe von membranverankerten Oberflächenproteinen auf, die als Lipoproteine bezeichnet werden. Obwohl sie eine tragende Rolle im Infektionsgeschehen spielen, ist die Mehrzahl dieser Proteine funktionell uncharakterisiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion von Lipoproteinen in S. aureus zu untersuchen. Im ersten Schritt wurde hierzu ein bioinformatischer Ansatz verfolgt, um das Pan-Lipoproteom von 123 S. aureus Stämmen zu definieren. Hierbei wurden 192 Lipoproteine identifiziert, von denen 39 dem Core- und 153 dem variablen Lipoproteom zugeordnet wurden. Von den identifizierten 192 Lipoproteinen sind 141 bisher unbekannter Funktion. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden 22 Lipoproteine - unbekannter, bzw. kaum charakterisierter Funktion - die hauptsächlich dem Core-Lipoproteom zuzuordnen sind, sowie zwei Nachbarproteine von Lipoproteinen für eine weitere Charakterisierung ausgewählt. Von diesen insgesamt 24 Proteinen wiederum wurden 20 markerlos in S. aureus Newman deletiert (S. aureus delta l01 – delta l20). Diese 20 Mutanten wurden anschließend auf phänotypische Veränderungen hinsichtlich ihres Wachstums unter verschiedenen Stress-Bedingungen getestet. Hierbei fielen drei Mutanten als temperatursensitiv auf, zwei Mutanten bildeten Zellklumpen in TSB des Herstellers Merck (TSBMerck) und vier Mutanten zeigten ein reduziertes Wachstum unter osmotischem Stress. Ein verändertes Aggregationsverhalten konnte bei vier Mutanten unter Einfluss von Detergentien beobachtet werden. Zehn Mutanten zeigten sowohl verminderte Biofilmbildung als auch ein reduziertes Hämolyseverhalten. Unter allen Wachstums- bzw. Stress-Bedingungen waren delta l14 (delta NWMN_1435) und delta l16 (delta NWMN_0646) auffällig, die sich durch ihre besondere Zellmorphologie und einen stark veränderten Zellteilungsprozess während der transienten Wachstumsphase in TSBMerck auszeichneten. Diese zwei Mutanten wurden anschließend für eine weiterführende Charakterisierung ausgewählt. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten für Zellen von S. aureus delta l14 und delta l16 in TSBMerck eine irreguläre, vergrößerte Gestalt, multiple und fehlplatzierte Teilungssepten sowie eine unvollständige Separation der Tochterzellen, die zur Formierung von Aggregaten führte. Microarray-basierte Transkriptom-Analysen beider Mutanten, sowie whole-genome-sequencing von Suppressormutanten wiesen auf eine Funktion von L14 und L16 in Zellhüllen- oder Zellteilungsprozessen hin. Befunde aus diesen Analysen deuteten auf einen funktionellen Zusammenhang beider Lipopoteine mit Lipo- oder Wandteichonsäuren hin. Interessanterweise konnte der Mutantenphänotyp von S. aureus delta l14 und delta l16 nur unter bestimmten Bedingungen beobachtet werden. Fraglich bleibt daher, ob die Funktion beider Lipoproteine durch metabolische Prozesse moduliert wird, oder ob die Lipoproteine Teil eines „Backup Systems“ sein könnten, das nur unter bestimmten Bedingungen für die S. aureus Zelle von Relevanz ist. Zusammenfassend scheinen L14 und L16 eine wichtige Rolle in Zellhüllen- oder Zellteilungsprozessen einzunehmen, die unter bestimmten Bedingungen zum Tragen kommt. Möglicherweise sind sie hierbei für die Funktionalisierung oder Lokalisation von Lipo- oder Wandteichonsäuren, und damit auch für Kontrolle von Autolysinen verantwortlich. Somit liefert diese Arbeit wichtige Anhaltspunkte für die Funktion von zwei bisher uncharakterisierten, hochkonservierten Lipoproteinen in S. aureus.

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Metadaten
Author: Anica Graf
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-41371
Title Additional (German):Funktionelle Charakterisierung von Lipoproteinen in Staphylococcus aureus
Referee:Prof. Dr. Katharina Riedel, Prof. Dr. Eva Medina
Advisor:Prof. Dr. Katharina Riedel, Dr. Jan Pané-Farré
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/12/17
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/11/23
Release Date:2020/12/17
Tag:Bacterial cell membrane, Bacterial cell wall, Cell aggregation, Cell division defect, Functional characterization, Lipoproteins, Pan-lipoproteome analysis, Staphylococcus aureus, Teichoic acid
GND Keyword:Lipoproteine, Molekularbiologie, Staphylococcus aureus
Pagenumber:170
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie