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Stefanie Stremlau

• Anorganische Stickstoffformen, wie Nitrat oder Nitrit, dienen in Pflanzen als Quelle für die enzymatische Bildung des Signalmoleküls Stickstoffmonoxid (NO). In Wurzeln wird NO an der apoplastischen Seite der Plasmamembran (PM) durch die Nitrit:NO-Reduktase (NI-NOR) gebildet, die für Nitrit eine hohe Affinität aufweist. Die dafür benötigten Elektronen stammen aus der Oxidation von Succinat, wobei in vitro auch Elektronen aus reduziertem Cytochrom c akzeptiert werden. Zur fluoreszenzmikroskopischen Lokalisierung der NI-NOR (in planta) innerhalb der Tabakwurzeln (Nicotiana tabacum cv. Samsun) wurden DAF-Farbstoffe (Diaminofluoresceine) eingesetzt, die sich jedoch aufgrund zahlreicher NO-unspezifische Reaktionen zum Nachweis der NI-NOR unter den gegebenen experimentellen Bedingungen nicht eigneten. Die Bestimmung und Quantifizierung der NI-NOR-Aktivität in vitro, an isolierten PM-Vesikeln, solubilisierten PM-Proteinen und partiell gereinigten PM-Proteinen, erfolgte mittels Chemilumineszenzanalyse. Neben NO wurde unter Anwendung der Membran-Inlet-Massenspektrometrie an PM-Vesikeln außerdem die Bildung von N2O und NO2 nachgewiesen. In Abhängigkeit von der externen Nitraternährung der Tabakpflanzen bestand ein Zusammenhang zwischen der NI-NOR-Aktivität und der Kolonisierungsrate der Wurzeln mit dem vesikulär-arbuskulären Mykorrhizapilz Glomus mosseae, wobei geringe NI-NOR-Aktivitäten unter Stickstoffmangelbedingungen mit hohen Kolonisierungsraten und umgekehrt hohe NI-NOR-Aktivitäten bei optimaler Nitraternährung mit geringen Kolonisierungsraten korrelierten. Die NI-NOR-Aktivität wurde konzentrationsabhängig und reversibel durch die Anwesenheit von Sauerstoff gehemmt und erreichte bei einer Luftsauerstoffkonzentration von 21 % noch etwa 22 % ihrer ursprünglichen, unter anoxischen Bedingungen gemessenen Aktivität. Um die Identität dieses Enzyms über massenspektrometrische Analysen zu klären, wurde die NI-NOR ausgehend von isolierten PM-Vesikeln aus Tabakwurzeln durch Solubilisierung sowie über chromatographische und gelelektrophoretische Trennungsmethoden aufgereinigt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie wurden vor allem verschiedene Aquaporine und Kanäle sowie einige noch unbekannte Proteine identifiziert, bei denen es sich möglicherweise um die NI-NOR handeln könnte. Eine Oxidoreduktase, als möglicher Kandidat für die NI-NOR, wurde jedoch nicht gefunden.
• Inorganic forms of oxidized nitrogen, as nitrate and nitrite, serve as sources for enzymatic formation of the signalling compound nitric oxide (NO) in plants. At the apoplastic face of root plasma membranes, NO is produced by nitrite:NO reductase (NI-NOR), an enzyme with high affinity towards its substrate nitrite. Electrons for this reaction derived from the oxidation of succinate. In vitro, NI-NOR accepts also electrons from reduced cytochrome c. Diaminofluoresceins (DAF) were used to localise NI-NOR activity within the root tissues of tobacco plants (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun) by fluorescence microscopy in planta. Under the applied experimental conditions, the DAF dyes turned out to be NO unspecific and were therefore unsuitable for the detection of NI-NOR activity. Enzymatic NO formation by isolated plasma membrane vesicles, solubilised and partially purified plasma membrane proteins was analyzed by chemiluminescence in vitro. Beside NO, also N2O and NO2 were shown to be produced by purified plasma membrane vesicles using membrane inlet mass spectrometry. Depending on nitrate supply, a correlation between NI-NOR activity and root colonisation rate with the vesicular arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae was found. Low NI-NOR activity under nitrate deficiency corresponded to a high colonisation rate whereas high NI-NOR activity under optimal nitrate supply was found with a low colonisation rate. NI-NOR activity was proven to be reversibly inhibited by oxygen in a concentration dependent manner. In ambient air, NI-NOR activity attained about 22 % of its activity measured under anoxia. To identify NI-NOR by mass spectrometry, the enzyme was enriched from isolated plasma membrane vesicles by solubilisation, chromatography and gel electrophoresis. Different aquaporines, membrane channel proteins and some so far unknown proteins were identified by mass spectrometry. The latter are possible candidates for NI-NOR. However, no oxidoreductase, as expected for NI-NOR, was found.