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Catharina Keßler

• Die Afrikanische Schweinepest (ASP) ist eine Viruserkrankung, die Mitglieder der Suidae-Familie wie Buschschweine, Warzenschweine, Hausschweine und Wildschweine befällt. Das Virus wird durch direkten Kontakt zwischen infizierten und naiven Tieren, durch Zecken der Gattung Ornithodoros oder durch Kontakt mit kontaminiertem Material übertragen. Während die Krankheit bei Warzenschweinen und Buschschweinen im Allgemeinen asymptomatisch verläuft, verursacht die ASP eine hohe Mortalität bei Hausschweinen und Wildschweinen. Daher ist die jüngste Ausbreitung von ASP in Europa eine ernste Bedrohung für die Schweinehaltung in der EU. Bis heute ist keine wirksame Behandlung oder Impfung verfügbar. Und es liegen nur wenige Informationen über Virus-Wirt-Wechselwirkungen vor, die als Grundlage für die Etablierung antiviraler Strategien verwendet werden könnten. Das Virus der afrikanischen Schweinepest (African swine fever virus, ASFV) ist der einzige bekannte Vertreter der Familie der Asfarviridae. Das DNA-Genom des ASFV kodiert für über 150 Gene. Über die Expressionsprodukte ist wenig bekannt, nur wenige virale Proteine sind bisher funktionell charakterisiert. Die Morphogenese von ASFV ist sehr komplex. So entstehen neben den zweifach umhüllten reifen extrazellulären Virionen auch einfach umhüllte intrazelluläre Partikel, die die die Präparation reiner extrazellulären Virionen erschweren. In früheren in vitro Studien wurde die Zusammensetzung der extrazellulären Viruspartikel mittels 2D-Gelelektrophorese analysiert. Die Reinigung erfolgte über ein im Jahre 1985 veröffentlichtes Reinigungsprotokoll, welches auf einer Percolldichtegradientenzentrifugation und einer Gelchromatographie basierte. Das Protokoll wurde für die Reinigung des auf Vero-zellen adaptierten Virusstamm Ba-71V etabliert. In einer frühen MS Studie wurden 54 Proteine in ASFV Partikeln detektiert, 15 davon Wirtsproteine. Der Einbau von Aktin, α-Tubulin und β-Tubulin ins Virion konnte ebenfalls bestätigt werden. Systematische massenspektrometrische Untersuchungen zur Charakterisierung des Proteoms der ASF Virionen lagen zu Beginn der vorliegenden Dissertation nicht vor, erst während der Anfertigung des Manuskripts wurde eine solche Studie durch Alejo et al. veröffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf einer Dichtegradientenzentrifugation ohne nachfolgende Gelchromatographie beruhendes Reinigungsprotokoll entwickelt und die Zusammensetzung reifer ASF Viruspartikel mittels MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie analysiert. Zur Anzucht einer GFP-positiven ASFV OUR T88/3 Mutante wurde die vom Wildschwein abstammende Zelllinie WSL-HP verwendet. Wesentliche Schritte der Reinigung waren eine niedertourige Zentrifugation zur Entfernung zellulärer Verunreinigungen, gefolgt von einer Sedimentation des Virus durch ein Saccharosekissen und einem Proteaseverdau. Final wurde die Präparation über einen selbstgenerierenden Optiprep™ Dichtegradienten gereinigt. Die Titerausbeute lag zwischen 30 und 70 %, die spezifische Infektiosität bei 2,4 x 109 TCID50/mg. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Präparation zwar Virionen enthielt, aber auch, dass die Fixierung mit Glutaraldehyd die Stabilität der Virionen beeinträchtigt. In der massenspektrometrischen Analyse wurden 29 der 33 bekannten ASFV Strukturproteine bestätigt. Von den neu identifizierten Strukturproteinen konnten vier (pK145R, pC129R, pE146L und pI73R) in allen drei Replikaten und sechs in zwei von drei Replikaten (p5, CP123L, CP312R, E184L, M1249L und M2248R) bestätigt werden. Ein weiteres bis dato nicht charakterisiertes Protein, p285L, konnte als mögliches neues Strukturprotein identifiziert werden. 152 Wirtsproteine wurden im Virion detektiert, darunter hauptsächlich Membranproteine oder Proteine des Zytoskeletts. Daneben wurde eine Reihe an phospholipidbindenden Proteine gefunden. Unter den identifizierten Proteinen waren fünf aus dem glatten ER und einige Vertreter der Hitzeschockproteine. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte das intrazelluläre Proteom des ASFV identifiziert werden. Für diese Untersuchungen wurden drei empfänglichen Zelllinien verwendet, die vom Wildschwein abstammenden Linie WSL-HP, Vero Zellen, die in der Vergangenheit für viele Studien herangezogen wurde und die menschliche Linie HEK-293, die aus einem weiteren nicht empfänglichen Wirt stammt. Der in dieser Studie verwendete Virusstamm ASFV OUR T88/3 besitzt 157 ORFs. In früheren Studien konnte die Existenz eines Proteins für 44 ORFs bestätigt werden. Für weitere 69 ORFs wurden Transkripte, nicht aber die korrespondierenden Proteine, beschrieben, sodass für 44 ORFs kein Nachweis der Expression vorlag. In der massenspektrometrischen Analyse wurden je Wirtszelle rund 1000 Proteine identifiziert. Insgesamt belief sich die Zahl der identifizierten ASFV Proteine auf 94, davon 88 in WSL-HP, 83 in Vero und 57 in HEK-293 Zellen. 54 ASFV Proteine wurden in allen drei Zelllinien detektiert. Für 34 der identifizierten ASFV Proteine war bisher nur die Existenz des Transkripts beschrieben, für 23 weitere weder die Existenz eines Proteins noch eines Transkripts. Für 44 der 94 identifizierten Proteine wurde das N-terminales Peptid detektiert. Bei fünf der MGF-110 Proteinen (1L, 2L, 4L, 5L und 14L) und den Proteinen pI329L und pCP123L wurde die Abspaltung der vorhergesagten Signalsequenz experimentell bestätigt. Die MS Analysen wurden unter Verwendung des emPAI auch quantitativ ausgewertet. Die geringe Zahl detektierter ASFV Proteine in HEK-293 Zellen korrelierte mit dem geringeren Anteil an ASFV Proteinen im Gesamtproteingehalt der Zelle (6,3 Mol%). Allerdings wurden einige Proteine in HEK-293 Zellen ähnlich stark oder sogar stärker exprimiert als in Vero bzw. WSL-HP Zellen. Die Abundanz einzelner ASFV Proteine variierte in den verschiedenen Zelllinien. Einige wurden jedoch durchgehend stark exprimiert wie z.B. das Strukturprotein p11.5. Einige bisher nicht charakterisierte Proteine, wie z.B. pK145R, pI73R und pC129R, wurden überraschenderweise ebenfalls in allen Zellen stark exprimiert und sind somit möglicherweise Träger wichtiger viraler Funktionen, die weiter untersucht werden sollten.
• African swine fever (ASP) is a virus disease, which affects members of the Suidae family such as warthogs, bush pigs, wild boars and domestic pigs. The virus is transmitted by direct contact between infected and naive animals, by ticks of the genus Ornithodoros or by contact with contaminated material. While the disease is generally asymptotic in warthogs and bush pigs, ASP causes high mortality among domestic swine and wild boar. Therefore, the recent spread of ASP in European countries poses a serious threat to pig farming in the EU. In addition, no effective treatment or vaccine is available to date. Literature on virus-host interactions which could be used as basis for antiviral strategies is scarce. the African swine fever virus (ASFV) is the only known member of the Asfarviridae family. The DNA genome of ASFV codes for over 150 genes. Knowledge about the expression products of individual genes is scarce and only a few proteins have been functionally characterized. The morphogenesis of ASFV is very complex. In addition to the doubly enveloped mature extracellular virion, intracellular virions carry only a single envelope, which complicates the preparation of pure extracellular virions. In previous in vitro studies, the composition of extracellular virus particles was analyzed by 2D gel electrophoresis. A purification protocol published in 1985 based on Percoll density gradient centrifugation and gel chromatography was used. The protocol was established for the purification of the Vero cell-adapted virus strain Ba-71V. It has been shown that this protocol is not suitable for the purification of field strains grown on macrophages. In this study, 54 proteins were detected in ASFV particles, 15 of which were identified as host proteins. The incorporation of actin, α-tubulin and β-tubulin into the virion could also be confirmed. So far, 33 viral structural proteins were known. In a MS study published very recently (38) 48 viral structural proteins have been described. In this dissertation, a purification protocol based on density gradient centrifugation without subsequent gel chromatography was developed and the composition of mature ASFV particles was analyzed by MALDI-TOF / TOF mass spectrometry. A GFP-positive ASFV OUR T88 / 3 mutant was propagated on the wild boar-derived cell line WSL-HP. Essential steps of the purification were a low speed centrifugation to remove cellular debris, followed by a sedimentation of the virus through a sucrose cushion and a protease digestion. Finally, the preparation was purified using a self-generating Optiprep ™ density gradient. The titer yield was between 30 and 70%, the specific infectivity 2.4 x 109 TCID50 / mg. Electron microscopic studies showed that the preparation contained virions but also that fixation with glutaraldehyde interfered with the stability of the virions. In mass spectrometric analysis, 29 of the known 33 ASFV structural proteins could be confirmed. Four of the newly detected structural proteins could be confirmed in all three replicates (pK145R, pC129R, pE146L and pI73R) and further six in two out of three replicates (p5, CP123L, CP312R, E184L, M1249L and M2248R). Another previously uncharacterized protein, p285L, could be identified as a potential new structural protein. 152 host proteins were detected in the virion, including mainly membrane proteins or cytoskeletal proteins. In addition, a number of phospholipid-binding proteins were found. Among the identified proteins were five from the smooth ER and several members of the heat shock proteins. In the second part of this work, the intracellular proteome of the ASFV was characterized. For these studies, three susceptible cell lines were used, the wild boar-derived line WSL-HP, Vero, which have been used in many studies in the past, and the human HEK-293, which represents another non-susceptible host. The virus strain ASFV OUR T88 / 3 used in this study has 157 ORFs. In previous studies, the expression of a protein of 44 ORFs or their homologues from other ASFV strains could be confirmed. For further 69 ORFs transcripts, but not the corresponding proteins, were described in the literature, so that for 44 ORFs there is still no proof of expression. In mass spectrometric analysis, roughly 1000 proteins of each host species were identified. In total, the number of identified ASFV proteins was 94, of which 88 were expressed in WSL-HP, 83 in Vero, and 57 in HEK-293 cells. Fifty-four ASFV proteins were detected in all three cell lines. For 34 of the identified ASFV proteins, only the existence of the transcript has been described, for 23 others neither the existence of a protein nor a transcript has been documented. For 44 of the 94 identified proteins, the N-terminal peptide was detected. For five of the identified MGF 110 proteins (1L, 2L, 4L, 5L and 14L) and for proteins pI329L and pCP123L, cleavage of a predicted signal sequence was confirmed. The MS analyses were also quantitatively evaluated. The small number of detected ASFV proteins in HEK-293 cells correlated with the lower protein content of ASFV proteins in relation to the total protein content of the cell (6.3 mol%). However, some proteins were expressed in HEK-293 cells at the same or even higher levels than in Vero or WSL-HP cells. The abundance of individual ASFV proteins varied in the different cell lines, but some were strongly expressed, among them, surprisingly, a number of previously uncharacterized proteins such as pK145R, pI73R or pC129R. We hypothesize that these may be carriers of important viral functions and should therefore be further investigated.