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Untersuchung des Einflusses von Palladin auf das Aktinzytoskelett von Podozyten

  • Für eine intakte Filtration des Blutes sind hochspezialisierte Epithelzellen in den Glomeruli der Nieren, die Podozyten, essentiell. Der Verlust oder die Schädigung dieser postmitotischen Epithelzellen bzw. morphologische Veränderungen der komplex geformten Fortsätze dieser Zellen sind die häufigsten Ursachen für den Verlust der Filtrationsfähigkeit der Nieren. Diese besondere 3D-Morphologie der Podozyten hängt entscheidend vom Aktinzytoskelett und von Aktin-bindenden Proteinen ab. Aus der Literatur weiß man, dass das Aktin-bindende Protein Palladin einen entscheidenden Einfluss auf die Nukleation bzw. Polymerisation von Aktinfilamenten ausübt und dass Palladin sowohl die Morphologie als auch die Dynamik von Zellen bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Palladin hinsichtlich der Podozytenmorphologie und -funktion in vitro und in vivo erstmals untersucht. Mittels in vitro Experimenten an kultivierten Podozyten der Maus konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von Palladin zu einer deutlichen Abnahme der Aktinfilamente und kleineren Fokalkontakte führt. Interessanterweise hatte dies aber keinen Einfluss auf die Adhäsionfähigkeit der Podozyten, sogar unter mechanischer Bean¬spruchung. Ferner konnte gezeigt werden, dass Palladin einen entscheidenden Einfluss auf die Expression anderer essentieller Aktin-assoziierter Proteine, wie Synaptopodin und α-Aktinin-4, aufweist. Dass Palladin eine wichtige Rolle bei der Bildung und Stabilität von Aktinfilamenten spielt, konnte durch die Inkubation von kultivierten Palladin Knockdown-Podozyten mit verschiedenen Inhibitoren der Aktin-Polymerisation gezeigt werden. Die quantitative Auswertung mit Hilfe der Software F_Seg zeigte, dass Palladin Knockdown-Podozyten nach der Inkubation deutlich weniger Aktinfilamente und mehr Aktin-Cluster im Vergleich zu den Kontrollen aufweisen. Der Einsatz eines Migrations-Assays zeigte zudem, dass kultivierte Palladin Knockdown-Podozyten schneller migrieren und vermehrt dynamische Strukturen wie Lamellipodien und sogenannte Ring-Like-Structures (RiLiS) ausbilden. Um den Einfluss von Palladin auf Podozyten in vivo zu untersuchen, wurden Mäuse generiert, bei denen Palladin spezifisch in den Podozyten ausgeknockt ist. Analysen der Glomeruli-Morphologie dieser Tiere mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Superresolution- und Elektronenmikroskopie (Raster- und Transmissionsmikros-kopie) zeigten eindeutig, dass die glomerulären Kapillaren stark erweitert waren und sich ein stark vergrößerter sub-podozytärer Raum ausgebildet hatte. Ferner waren die für die Filtration des Blutes maßgeblichen Fortsätze der Podozyten stark verbreitert und die Expression des essentiellen Schlitzmembranproteins Nephrin nach dem Knockout von Palladin signifikant reduziert. Durch den Einsatz eines nephrotoxischen Serums wurde eine Glomerulonephritis induziert, die bei Podozyten-spezifischen Palladin-Knockout Mäusen zu einer stärkeren Schädigung der Glomeruli im Vergleich zu den Kontrolltieren führte. Dies deutet auf eine essentielle Rolle von Palladin für die Morphologie und Funktion der Filtrationsbarriere hin. Des Weiteren konnte anhand von Nierenbiopsien nachgewiesen werden, dass die Palladin-Expression bei Patienten, die an einer fokal segmentalen Glomerulosklerose bzw. an der diabetischen Nephropathie erkrankt waren, im Vergleich zu den Kontrollnieren deutlich verringert ist. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass Palladin sowohl in vitro als auch in vivo einen entscheidenden Einfluss auf das Aktin-zytoskelett der Podozyten und somit auf die Funktion dieser hochspezialisierten Epithelzelle hat.
  • A highly specialized epithelial cell type in the kidney, the podocyte, is essential for proper blood filtration. Detachment of these postmitotic epithelial cells or morphological changes of podocyte foot processes that are attached to the outer aspect of the capillaries in the filter unit of the kidney - the glomerulus - are the most common causes for a loss of the size selectivity of the filtration barrier. This results in the excretion of high molecular weight proteins via the urine. The morphology of the podocyte foot processes is critically dependent on an intact actin cytoskeleton and on actin-binding proteins. Since it is well-known that the actin-binding protein palladin is important for actin nucleation and polymerization as well as for the stability of the actin cytoskeleton, we studied the influence of palladin on podocyte morphology and function in vitro and in vivo. In vitro experiments of cultured mouse podocytes showed that the knockdown of palladin resulted in a significant reduction of actin filaments and the formation of smaller focal adhesions. However, we saw no effect on the adhesion of podocytes under mechanical stress. However, we found that palladin is essential for the expression of other important and podocyte-specific proteins like synaptopodin and α-actinin-4. To reveal the role of palladin for the formation and stability of actin filaments, cultured palladin knockdown-podocytes were treated with inhibitors of actin polymerization. Quantitative analysis using the software F_Seg showed significantly fewer actin filaments and more actin-clusters in palladin knockdown podocytes after incubation with the inhibitors compared to the controls. Migration-assays showed further that cultured palladin knockdown-podocytes migrated faster and had more dynamic structures like lamellipodia and so called ring-like-structures (RiLiS). To investigate the influence of palladin in podocytes in vivo, mice were generated with a specific knockout of palladin in podocytes. Examinations of glomeruli morphology using immunofluorescence, super-resolution and electron microscopy (scanning and transmission microscopy) showed that the glomerular capillaries were highly dilated and had an enlarged sub-podocyte space. In addition, podocyte foot processes, were significantly broadened and the expression of the transmembrane protein nephrin, an essential component of the slit membrane, was significantly reduced after the knockout of palladin. To challenge podocytes in vivo, a specific podocyte-related kidney damage was induced by the injection of a nephrotoxic serum. We found an increase of damaged glomeruli in podocyte-specific palladin-knockout mice compared to the controls. This suggests an essential role of palladin for the morphology and function of the glomerulus. Moreover, renal biopsies showed a significant reduction of palladin in patients with podocyte-related diseases compared to controls. In summary, the results of this work show that palladin plays an important role for the dynamics and morphology of the actin cytoskeleton of podocytes in vitro and in vivo and further influences the severity of a podocyte-related disorder in mice.

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Metadaten
Author: Nadine Artelt
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-36172
Title Additional (English):Studying the role of palladin on the actin cytoskeleton of podocytes
Referee:Prof. Dr. Karlhans Endlich, Prof. Dr. Thomas Weide, Prof. Dr. Sigrid Hoffmann
Advisor:Prof. Dr. Karlhans Endlich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/04/01
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/02/06
Release Date:2020/04/01
Tag:Aktinzytoskelett; Palladin; Podozyt
GND Keyword:Niere, Aktin, Morphologie
Page Number:93
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Anatomie und Zellbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 500 Naturwissenschaften