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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002207-2

Etablierung neuer Modelle der Expressionsminderung zur funktionellen Analyse des (Pro)Reninrezeptors

  • Im Rahmen der Promotionsarbeit wurden Modelle der Expressionsminderung für In-vitro-Studien zur Wirkung des (Pro)Renin-Rezeptors ((P)RR) etabliert und Analysen hinsichtlich möglicher Effekte auf pH-Werte in Organellen im Vergleich zu den Effekten des spezifischen V-ATPase-Blockers Bafilomycin A durchgeführt. Einerseits erfolgte ein induzierter Knock-out mittels Cre/loxP-System bei embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF), andererseits wurde als mildere Alternative eines konsequenten Knock-out eine transiente Downregulation mittels siRNA smart Pool bei Renin sezernierenden As4.1-Zellen durchgeführt. Anhand beider Modelle konnte nachgewiesen werden, dass sich eine Expressionsminderung des (P)RR sowie ein V-ATPase-Block mittels Bafilomycin A1 negativ auf das Zellüberleben und auf die Proliferation der Zellen auswirkte. Bei den (P)RR-Knock-out-MEF kam es zu keinen pH-Wert-Veränderungen, während unter der Behandlung mit Bafilomycin A1 als Ursache für das Zellsterben eine eindeutige pH-Wert-Erhöhung in späten Endosomen und Lysosomen ausgemacht werden konnte. Sekretionsanalysen zur basalen Renin- und Proreninfreisetzung und Analysen zum jeweiligen Proteingehalt der As4.1-Zellen zeigten in den (P)RR-Knock-down-Zellen keine Veränderungen. Nur der spezifische Block der V-ATPasen mittels Bafilomycin A führte zu einer gesteigerten Rate der basalen Reninfreisetzung. Untersuchungen saurer Organellen der As4.1-Zellen ergaben hingegen interessante Ergebnisse: Während ein V-ATPase-Block erwartungsgemäß zu einer geringen Fluoreszenzintensität der pH-sensitiven Farbstoffe Lysosensor und Lysotracker führte, nahm die Intensität in (P)RR-Knock-down-Zellen überraschenderweise zu. Aus diesem gegensinnigen Effekt ließe sich die Hypothese ableiten, der (P)RR sei ein natürlicher Inhibitor der V-ATPase. Die direkte Interaktion beider Proteine und die Hemmung der V-ATPase-Aktivität durch den (P)RR/ATP6ap2 bleiben jedoch durch funktionelle Analysen zu überprüfen. Die Arbeit trägt mit der Etablierung neuer Modelle der (P)RR-Depletion sowie mit den Daten zu pH-Werten in Organellen zur Aufklärung der Wirkungen des (Pro)Renin-Rezeptors bei.
  • Binding of renin and its precursor prorenin to the (pro)renin receptor (P)RR enhances local angiotensin II formation and activates intracellular pathways related to fibrosis. However, a truncated form of the (P)RR was found to be associated with vacuolar H+-ATPasen (V-ATPase), implicating a fundamental role of the (P)RR in cellular physiology. We generated two in vitro models, a stable (P)RR-knockout in mouse embryonic fibroblasts (MEF) and a (P)RR-knockdown in renin producing As4.1-cells, to analyse the consequences of (P)RR loss and its function in intracellular acidification and (pro)renin release. We showed that (P)RR loss as well as a specific block of the V-ATPase with bafilomycin A1 resulted in cell death of MEF and As4.1-cells. (P)RR-knockout in MEF didn’t alter the pH in late endosomes and lysosomes while treatment with bafilomycin A1 resulted in an increased pH of these intracellular vesicles leading to cell death. In As4.1-cells treatment with bafilomycin A1 decreased fluorescence intensity of Lysotracker and Lysosensor implicating an impaired vesicular acidification. Instead, (P)RR-knockdown resulted in an increased fluorescence intensity raising the question, if the (P)RR is a physiological inhibitor of the V-ATPase in As4.1 cells. Basal (pro)renin release was not altered by (P)RR-knockdown. Taken together, these results show that the (P)RR is essential for cell survival and therefore a transient knockdown is the better choice for functional analyses than a complete knockout. Furthermore, (P)RR seems to regulate V-ATPase function, but the molecular mechanism remains to be identified.

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Metadaten
Author: Inga Carolin Czauderna
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002207-2
Title Additional (English):Establishment of new models of (pro)renin receptor downregulation for functional analyses.
Advisor:Dr. Heike Wanka, Prof. Dr. Jörg Peters
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/04/14
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/03/24
Release Date:2015/04/14
Tag:(Pro)renin-Sekretion, (Pro)reninrezeptor, Bafilomycin A1, V-ATPase
(pro)renin receptor, (pro)renin release, V-ATPase, bafilomycin A1
GND Keyword:Prorenin, Renin
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Physiologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit