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Proteome analysis of chicken lymphocytes after infection and transformation by the oncogenic Marek’s disease virus

  • The highly oncogenic alphaherpesvirus Marek’s disease virus (MDV) causes immense economic losses in the poultry industry. The main targets of in vivo MDV infection are primary B and T lymphocytes. The cytolytic infection of B cells leads to depletion of lymphoid cells results in severe immunosuppression. Infected B cells recruit and activate T cells. The close interaction between B cells and T cells enables efficient intercellular transfer of MDV. During infection of T cells, the virus enters a latent state. Infection of T cells can lead to transformation of these cells and formation of lymphoma, which manifest in various visceral organs. This study aimed at the characterization of the proteomes of MDV-infected lymphocytes during the lytic and latent phases of infection. Previous in vitro studies concerning the MDV pathogenesis and host-virus interactions have been mainly conducted with primary fibroblasts or kidney cells, due to the short lifespan of primary lymphocytes in cell culture. Recently, a cultivation system has been established that extents the lifespan of primary lymphocytes through the addition of cytokines to the growth medium. This allowed the infection of B cells in vitro and to conduct quantitative proteomic analysis of primary lymphocytes. Infection with GFP labelled virus recombinants allowed the isolation of infected cells by FACS for the proteome analysis of MDV infected B lymphocytes. An efficient quantitative proteomic workflow was developed, which consisted of a filter-aided (FASP) digest of the extracted proteins, followed by differential dimethyl chemical labeling of the peptides for quantitative evaluation prior to LC-MALDI TOF/TOF mass spectrometry. Only few alterations of the protein and transcript expression profiles were observed after infection of primary B cells with the very virulent RB-1B and the live-attenuated vaccine strain CVI988/Rispens. Relevant changes in relative protein levels were found for only twelve and six interesting host proteins after RB1B and CVI988 infection, respectively. However, the regulations were confirmed by inspection of the spectra from all experiments. The identified candidates play a role in immune response, translation and inflammatory response. To confirm the potential infection markers, RNA-seq analysis of three biological replicates of each RB-1B -, CVI988- and mock-infected B cells was performed. Eighty expressed MDV transcripts could be identified, which were associated with lytic infection. The same MDV proteins were identified after infection with RB-1B or CVI988. However, transcriptome and proteome analysis of MDV-infected primary B cells showed only poor correlation. This indicates that the changes in protein expression profiles are mostly due to posttranscriptional events. Infection marker candidates were identified by the RNA-seq analysis, for which the gene expression was altered by MDV infection. Although almost 12,000 transcripts were identified, only few transcript levels changed markedly after MDV infection. The biological processes immune response, apoptotic process, signal transduction, cell migration and response to virus were enriched after MDV infection. The RNA-seq results confirm the observation that alterations of protein levels early after MDV infection are rare. Most notably, MDV induces transformation of lymphocytes leading to malignant T-cell lymphomas in visceral organs with mortalities of up to 100 %. While several factors involved in MDV tumorigenesis have been identified, the transformation process is not fully understood. Therefore, we set out to fill this knowledge gap using proteome analysis of transformed T-cells ex vivo. In addition, the role of the viral telomerase RNA during transformation was assessed by comparison of tumors that had formed after infection with WT-virus or a telomerase RNA negative mutant. A major obstacle for tumor proteome analyses is the preparation of sufficient amounts of homogenous tumor tissue, as tumors appear with a dispersed morphology in the affected organs. The quantitation of cell types within the tumors indicated varying portions of hepatocytes, connective tissue, and CD3+ lymphocytes even with the same virus strain in different animals. However, the ∆vTR-induced tumors contained lower levels of hepatocytes and higher levels of CD3+ lymphocytes compared to WT tumors in all tested tumor samples. Thus, ∆vTR tumors were chosen for determination of differences in protein expression profiles of tumors and naïve T cells for their lower content of liver cells. We developed a workflow for the proteome analysis of T cell tumors from livers of MDV-infected chickens. Samples included laser capture micro-dissected tissue cuts from tumors and surrounding healthy liver tissue as well as naïve T-cells prepared from thymus. To enable quantitative proteome analysis, samples were digested using the FASP protocol and peptides were isotope-coded by differential dimethyl labeling. To improve proteome analysis peptides were fractionated by preparative isoelectric focusing prior to nano-HPLC MALDI/TOF-TOF mass- spectrometric analysis. Proteomic analyses of LCM dissected ΔvTR tumor compared to naïve T cells, the main targets of transformation, identified nineteen potential transformation markers but again only minor changes in relative levels were observed. Several of the identified markers could also be verified by RT-qPCR on transcript level. The identified transformation candidates were associated with nucleosome assembly, regulation of transcription, inflammatory response, immune response and oxidation-reduction process. However, further functional analyses are necessary to fully elucidate the role of the identified markers during MDV infection and transformation.
  • Das onkogene Alphaherpesvirus der Marek’schen Krankheit (MDV) verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste in der Geflügelindustrie. Die wesentlichen Zielzellen einer natürlichen MDV Infektion sind primäre B- und T Lymphozyten. Die zytolytische Infektion von B Zellen führt zu deren Depletion und damit zu einer schweren Immunsuppression. Die Infektion von B Zellen führt auch zur Rekrutierung und Aktivierung von T Zellen. Die enge Interaktion zwischen B- und T Zellen ermöglicht die Übertragung von MDV zwischen den Lymphozyten. Während der Infektion von T Zellen bildet das Virus Latenz aus. Die Infektion der T Zellen kann zur Transformation und der Bildung von Lymphomen führen, die sich in verschiedenen viszeralen Organen manifestieren. Diese Studie zielt auf die Charakterisierung der Proteome von MDV-infizierten primären Lymphozyten während der lytischen und latenten Phase ab. Frühere in vitro Studien bezüglich der MDV-Pathogenese und der Virus-Wirt-Interaktionen wurden aufgrund der kurzen Lebensdauer primärer Lymphozyten in Zellkultur hauptsächlich auf primären Fibroblasten oder Nierenzellen durchgeführt. Vor kurzem wurde ein neues Zellkultursystem etabliert, welches die Lebensdauer der primären Lymphozyten durch die Zugabe von Zytokinen zum Zellkulturmedium verlängert. Dies ermöglichte die in vitro Infektion von B Zellen und die Durchführung quantitativer Proteomanalysen von primären Lymphozyten. Die Infektion mit GFP-markierten Virusrekombinanten erlaubte die Isolierung infizierter Zellen durch FACS vor der hier beschriebenen Proteomanalyse von MDV infizierten B Lymphozyten. Es wurde ein effizientes Protokoll zur quantitativen Analyse der Proteinexpression entwickelt. Dieses bestand aus einem Filter-gestützten (FASP) Verdau der extrahierten Proteine, gefolgt von der chemischen Einführung einer Isotopenmarkierung durch reduktive Dimethylierung der Peptide und anschließender LC-MALDI TOF/TOF massenspektrometrischen Analyse. Nach der Infektion der primären B Zellen mit dem sehr virulenten Stamm RB-1B und dem attenuierten Impfstamm CVI988/Rispens wurden nur wenige Änderungen in den Expressionsprofilen des Proteoms und des Transkriptoms beobachtet. Relevante Veränderungen der relativen Expressionsstärke der Proteine wurden für nur zwölf und sechs Wirtsproteine nach RB-1B- beziehungsweise CVI988-Infektion gefunden. Jedoch wurden die gleichen Proteine auch mit einer gleichsinnigen Regulierung in den Spektren der anderen Virusinfektion identifiziert. Die identifizierten Kandidaten spielen eine Rolle u.a. bei der Immunantwort, Translation und Entzündungsreaktion. Um die potenziellen Infektionsmarker zu bestätigen, wurde eine RNA-Sequenzierung von je drei biologischen Replikaten der einzelnen RB-1B-, CVI988- und scheininfizierten B Zellen durchgeführt. Achtzig MDV-Transkripte konnten identifiziert werden, die mit lytischen Infektionen assoziiert wurden. Die gleichen MDV-Proteine wurden nach einer Infektion mit RB-1B oder CVI988 identifiziert. Allerdings zeigten die Transkriptom- und Proteomanalysen von MDV-infizierten primären B Zellen eine schlechte Korrelation. Dies deutet darauf hin, dass die Veränderungen in der Proteinmenge vor allem auf posttranskriptionalen Ereignissen beruhen. Interessante Kandidaten wurden durch die RNA-Sequenzanalyse identifiziert, deren Transkriptmenge durch MDV-Infektion verändert waren. Nur wenige Änderungen wurden in dem Transkriptom der B Zellen nach MDV Infektion beobachtet, obwohl insgesamt fast 12.000 Transkripte identifiziert wurden. GO-Terme wie Immunantwort, apoptotische Prozesse, Signaltransduktion, Zellmigration und Antwort auf Virusinfektion wurden nach MDV Infektion angereichert. Die Ergebnisse der RNA-Seq bestätigen die oben genannten Beobachtungen der geringfügigen Änderungen durch MDV in dem zellularen Proteom während lytischer Infektion. MDV induziert die Transformation von Lymphozyten, was zu bösartigen T Zelllymphomen in viszeralen Organen führt und mit einer Mortalität von bis zu 100% einhergehen kann. Während schon mehrere Faktoren identifiziert wurden, die bei der MDV-induzierten Tumorentstehung eine Rolle spielen, ist der Transformationsprozess nicht vollständig verstanden. Diese Wissenslücke sollte mit einer ex vivo Proteomanalyse der transformierten T Zellen gefüllt werden. Darüber hinaus sollte die Rolle der viralen Telomerase RNA während der Transformation durch den Vergleich von Tumoren, die nach der Infektion mit WT-Virus oder einer Telomerase RNA negativen Mutante gebildet wurden, aufgeklärt werden. Ein großes Hindernis für Proteomanalysen von Tumoren ist die Gewinnung ausreichender Mengen an homogenem Tumorgewebe, da die Tumore in den betroffenen Organen disseminiert vorliegen. Die Quantifizierung der Zelltypen ergab schon beim gleichen Tumortyp stark streuende Anteile von Hepatozyten, Bindegewebe und CD3 + Lymphozyten in Proben aus verschiedenen Tieren. Makroskopische Präparate von Tumoren enthalten Kontaminationen von infiltrierendem gesundem Gewebe und die daraus resultierenden Proteomanalysen weisen eine niedrige Sensitivität auf. Da die vTR Tumore, trotz der Streuung den geringeren Leberzellanteil und höheren T-Zell Anteil zu haben schienen, wurde deren Analyse vorangestellt. So wurden ∆vTR Tumore zur Analyse von Proteinexpressionsprofil von Tumoren und naiven T Zellen verwendet. Dazu wurde ein Analysengang für die Proteomanalyse von reinen T Zelltumoren aus der Leber von MDV-infizierten Hühnern entwickelt. Zu den Proben gehörten mikrosezierte Gewebeschnitte von Tumoren und umliegendem gesunden Lebergewebe, sowie naive T Zellen, die aus Hühnerblut isoliert wurden. Um eine quantitative Proteomanalyse zu ermöglichen, wurden Proben mit dem FASP-Protokoll verdaut und die Peptide durch differentieller Dimethylmarkierung Isotopen-kodiert. Zur Verbesserung der Proteomanalyse wurden Peptide durch eine präparative isoelektrischen Fokussierung vor der Analyse durch Nano-HPLC MALDI/TOF-TOF Massenspektrometrie fraktioniert. Proteinanalysen von LCM-sezierten ΔvTR Tumoren im Vergleich zu naiven T Zellen, den Zielzellen der Transformation, identifizierten neunzehn potenzielle Transformationsmarker. Generell wurden wieder nur wenige Änderungen in der relativen Expressionsstärke der Proteine beobachtet. Mehrere der identifizierten Marker konnten auch durch eine RT-qPCR auf Transkriptebene verifiziert werden. Die identifizierten Transformationskandidaten werden laut Gene Ontology Datenbank mit dem Aufbau des Nukleosoms, der Regulation der Transkription, entzündlicher Reaktion, Immunantwort und Oxidations-Reduktions-Reaktion assoziiert. Allerdings müssen weitere funktionelle Analysen durchgeführt werden, um die Rolle der identifizierten Marker während der MDV-Infektion und-Transformation vollständig zu klären.

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Metadaten
Author: Viktoria Isabella Pauker
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-22756
Title Additional (German):Eine Proteomanalyse von Lymphozyten nach Infektion und Transformation mit dem onkogenen Virus der Marek’schen Krankheit
Referee:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter, Priv.-Doz. Dr. med. vet. Sonja Härtle
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2018
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2018/07/24
Release Date:2018/08/13
GND Keyword:Lymphozyt, Proteomanalyse, Virologie
Pagenumber:154
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie