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Characterization and Regulation of Virulence Factors in Staphylococcus aureus

  • Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. It’s multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the host’s immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor σB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor σB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and σB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on σB. A potential σB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, Tübingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, Tübingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.
  • Staphylococcus aureus ist ein humanpathogenes Bakterium, dessen vielfältige Adaptation an variable Wirtsbedingungen eine entsprechende enge Regulation der den Wirtsorganismus beeinflussenden Proteine, die Virulenzfaktoren, erfordert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Regulatoren betrachtet: (i) der globale Einfluß des Zwei-komponenten-Systems SaePQRS und (ii) die Regulation der Superantigen-Genexpression durch den alternativen Sigmafaktor σB. Zu Beginn dieser Arbeit waren einzelne Zielgene, die durch SaeR induziert wurden (hla, hlb, cap5, fnbA, coa), bekannt. Um erstmals einen breiteren Überblick über das Sae-Regulon zu erhalten, wurde der Einfluß von SaePQRS auf die Genexpression mittels Proteomics und Transcriptomics in zwei Stammhintergründen untersucht. Zusammenfassend führte eine Inaktivierung des Sae-Systems zur verminderten Expression von mindestens 18 sekretierten sowie 2 kovalent an die Zellwand gebundenen Proteinen. Unter anderem wurden bekannte Virulenzfaktoren wie die γ-Hemolysine HlgA, HlgB, HlgC, LukM und LukF, die angeborene Immunantwort modulierende Proteine wie Efb, CHIPS und SCIN-B sowie das Enterotoxin SEB Sae-abhängig exprimiert. SaeR fungiert als Aktivator der Transkription seiner Zielgene. Einige Proteine wurden in erhöhten Mengen im extrazellulären Proteom im Sae-negativen Hintergrund detektiert, diese Änderung erfolgte jedoch nicht auf der Trankriptionsebene. Die Expression von Virulenzfaktoren wird durch weitere globale Regulatoren bestimmt. Für fünf wesentliche Regulatoren, das Agr-System und sein Effektor-Molekül RNAIII, den alternativen Sigma-Faktor σB, das Zweikomponenten-System ArlRS sowie das DNA bindende Protein SarA konnte kein Einfluß von SaePQRS auf deren Transkription festgestellt werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Regulation der Genexpression einer Untergruppe von Virulenzfaktoren, den Superantigenen (SAgs) von S. aureus, durch SaePQRS und σB. Während Funktionsweise und Molekülstruktur der SAgs gut charakterisiert sind, war relativ wenig zur Regulation ihrer Genexpression bekannt. Sechs verschiedene S. aureus Stämme (zwei Laborstämme und vier Klinikisolate), die ein bis sieben SAg Gene tragen, wurden genutzt, um insgesamt zwölf SAgs hinsichtlich Transkription und mitogener Aktivität zu untersuchen. Die transkriptionellen Einheiten wurden mit Hilfe von Northern-Blot Experimenten charakterisiert. Die Expression der SAg Gene war abhängig von der Wachstumsphase. Während die egc-SAgs vorwiegend bei niedrigen optischen Dichten exprimiert wurden, wurde seb in der späten Wachstumsphase induziert. Im Gegensatz dazu erfolgte die Transkription von sea, seh, sek, seq, tst und sep konstant und wachstumsphasenunabhängig. Die Transkriptionsdaten wurden durch T-Zell Proliferationsassays bestätigt. Die Expression von seh, tst und die des egc-Operons war σB- abhängig. Vor seo, dem ersten Gen des egc-Operons, konnte ein wahrscheinlicher σB-abhängiger Promoter lokalisiert werden. Dagegen war die Expression von seb im sigB-negativen Hintergrund erhöht, möglicherweise durch indirekte Effekte. Die Expression von seb war SaePQRS-abhängig. Die Transkriptionsdaten wurden durch Western-Blot Experimente und T-Zell Proliferations-Assays bestätigt. Abhängig vom jeweiligen SAg Gen- Repertoire resultierte die Mutation von sigB in den verschiedenen Stämmen zu unterschiedlichen Phänotypen hinsichtlich ihrer mitogenen Aktivität. Neben gut charakterisierten Virulenzfaktoren gehören einige sekretierte Proteine bisher unbekannter Funktion zum Sae-Regulon. Vor dem Hintergrund, dass der Einfluß von SaePQRS auf Virulenzfaktoren beschränkt ist und besonders Modulatoren des angeborenen Immunsystems induziert, kann für diese zusätzlichen Proteine ebenfalls eine Rolle in der Virulenz von S. aureus vermutet werden. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde einer dieser potentiellen neuen Virulenzfaktoren, SACOL0908, studiert. In Kooperation mit der AG Prof. Stehle, Tübingen, wurde die Kristallstruktur gelöst. Die Proteinfaltung von SACOL0908 ist neu und zeigt geringe Ähnlichkeiten zu bekannten Proteinstrukturen. Recombinant exprimiertes SACOL0908 bindet an Granulozyten, phagozytierende und Bakterien abtötende Zellen der angeborenen Immunantwort. Der Rezeptor auf der Granulozyten-Oberfläche konnte mit Immunopräzipitation, Antikörper-Blocking Versuchen und funktionellen Assays in Kooperation mit der AG Prof. Peschel, Tübingen, bisher nicht identifiziert werden. Das SACOL0908 Gen wurde in zwei Stammhintergründen (COL und Newman) deletiert. Diese Mutanten werden aktuell zur Charakterisierung des Phänotyps in Maus- Infektions-Modellen genutzt.

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Metadaten
Author: Kathrin Kusch
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001216-8
Title Additional (German):Charakterisierung und Regulation von Virulenzfaktoren in Staphylococcus aureus
Advisor:Prof. Dr. Michael Hecker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2012/12/21
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/02/02
Release Date:2012/12/21
Tag:Sae, Transcriptomics, neue Virulenzfaktoren, sigB
Sae, Transcriptomics, new virulence factors, sigB
GND Keyword:MRSA, Proteomanalyse, Staphylococcus aureus, Superantigen, Virulenz
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie