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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002167-4

Entwicklung neuer Testsysteme zur Erfassung östrogener und androgener Wirkungen im Rahmen der Umweltanalytik

  • Viele als endokrine Disruptoren (EDCs) bezeichnete Schadstoffe gelangen in die Umwelt und können Veränderungen in der Entwicklung und der Funktion des Hormonsystems von Menschen und Tieren hervorrufen. Sie liegen häufig in niedrigen, physiologisch wirksamen Konzentrationen, sowie als Substanzgemische in komplexen Umweltproben vor. Zum Nachweis dieser Umweltchemikalien bedarf es der Entwicklung neuer, effizienter, benutzerfreundlicher und hoch sensitiver Detektionsmethoden. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung von zwei neuen bioanalytischen Testsystemen, welche das biologische Potential von EDCs zuverlässig bestimmen. Das erste System, der neue Arxula adeninivorans yeast androgen screen (A-YAS) Assay, ermöglicht die Detektion von (anti-)androgenen Aktivitäten von EDCs als Reinsubstanzen sowie von Umweltproben. Dieser in vitro Bioassay basiert auf transgenen A. adeninivorans-Zellen, welche konstitutiv das Gen des humanen Androgenrezeptors (hAR) exprimieren. Das induzierbare Gen des Reporterproteins Phytase K (phyK, aus Klebsiella sp. ASR1 stammend) steht unter Kontrolle des aus A. adeninivorans stammenden Glucoamylase(GAA)-Promotors, welcher durch die Insertion von hormone responsive elements (HREs) modifiziert wurde. Bei Anwesenheit von (anti-)androgen wirkenden Substanzen bindet ein Dimer des hAR-Liganden-Komplexes an die HRE-Sequenzen und reguliert die Reportergenexpression. Das gebildete Reporterprotein Phytase K wird in das Medium sezerniert und ermöglicht die photometrische Bestimmung der Absorption als Maß der rekombinanten Enzymaktivität, welche mit der Konzentration der (anti-)androgen wirkenden Substanzen korreliert. Die Xplor®2-Transformations-/Expressionsplattform wurde verwendet, um mitotisch stabile und resistenzmarkerfreie Hefetransformanden zu generieren und geeignete Vertreter als Biokomponenten des Assays zu selektieren. Der A-YAS Assay ist benutzerfreundlich, schnell (Inkubationszeiten zwischen 5 h und 24 h) und als Hochdurchsatzmethode im 96-iger Mikrotiterplattenformat anwendbar. Für die Referenzsubstanz 5α-Dihydrotestosteron wurden ein Wert für die mittlere effektive Konzentration (EC50) von 277,1 ng/l sowie Nachweis- und Bestimmungsgrenzen von 56,5 ng/l bzw. 76,5 ng/l bestimmt. Damit ist der A-YAS Assay der derzeit sensitivste Hefezell-basierte Assay zur Detektion von androgenen Aktivitäten. Darüber hinaus wurden die androgenen und anti-androgenen Aktivitäten verschiedener weiterer EDCs (natürlich vorkommende Androgene und Östrogene, Pharmazeutika, Biozide) ermittelt. Der A-YAS Assay stellt ein robustes Testsystem dar und kann zur Bestimmung der androgenen Äquivalentwerte (AEQs) von komplexen Umweltproben wie Urinen eingesetzt werden. Die durch den Bioassay ermittelten AEQs mehrerer Rinderurinproben korrelierten gut mit den AEQs, welche durch GC-MS Analyse der gleichen Proben bestimmt wurden. Das zweite in dieser Arbeit entwickelte Testsystem ist ein zellfreies Verfahren, welches der rezeptorselektiven Anreicherung und Detektion von östrogen und androgen wirkenden Substanzen dient. Dazu wurden sowohl die vollständigen als auch die für die Ligandenbindungsdomäne (LBD) codierenden Gensequenzen vom humanen Östrogenrezeptor α (hERα) und von hAR mit der codierenden DNA-Sequenz für einen Polyhistidin-Tag (His-Tag) fusioniert. Durch die Wahl geeigneter Expressionssysteme erfolgte die Synthese rekombinanter, N- bzw. C-terminal mit einem His-Tag fusionierte Rezeptorproteine in vier unterschiedlichen Wirtsorganismen, dem Bakterium Escherichia coli BL21(DE3), den Hefen A. adeninivorans und Hansenula polymorpha sowie der Pflanze Nicotiana benthamiana. Zur maximalen Akkumulation von rekombinantem Protein wurden die Kultivierungsparameter der einzelnen Organismen optimiert. Eine Reinigung der nach Zellaufschluss extrahierten Proteine erfolgte durch die Metall-affine Interaktion von His-Tag-Fusionsproteinen mit Ni(II)-Nitrilotriacetat(Ni-NTA)-Gruppen in der immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC). Die in E. coli BL21(DE3)/pET-23a(+)-LBD-hERα synthetisierte, C-terminal mit einem His-Tag fusionierte LBD von hERα (LBD-hERα-6Hp) konnte nach IMAC-Reinigung mit hoher Reinheit (>90 %) und in einer Konzentration von bis zu 4 mg/ml erhalten werden. Die Anwendung unterschiedlicher Ligandenbindungsassays wies die Funktionsfähigkeit des rekombinanten Proteins nach. Durch Immobilisierung auf einer Chipoberfläche und Integration in einer Durchflusszelle wurde LBD-hERα-6Hp zum einen in einem Anreicherungsverfahren eingesetzt, welches Analyte von bisher unbestimmbaren in detektierbare Konzentrationen überführt. Die spezifische Bindung von 17β-Estradiol (17β-E2) wurde anhand der im östrogen-sensitiven nAES-P Assay (Kaiser et al., 2010) bestimmten Wiederfindungsraten von 17β-E2 bestimmt, welche sich nach Inkubation in der Durchflusszelle verringerten. Durch Integration einer optischen Messmethode (Lumineszenz) wurde ein kompetitives Detektionsverfahren entwickelt. Durch den Einsatz von LBD-hERα-6Hp wurde die spezifische Bindung von 17β-E2 gezeigt. Das Detektionsverfahren kann zur sensitiven Bestimmung der hormonellen Aktivitäten von EDCs als Reinsubstanzen sowie in Umweltproben eingesetzt werden. Darüber hinaus könnte das Anreicherungsverfahren als Vorstufe von kostenaufwändigen Nachweisverfahren wie der GC-MS Analyse verwendet werden.
  • An array of pollutants, which act as endocrine disrupting chemicals (EDCs) are released into the environment and can cause changes in the development and function of the endocrine system of humans and animals. EDCs are often present in low abundance, but physiologically effective concentrations and occur also as mixtures of substances in complex environmental samples. The development of new, efficient, user-friendly and highly sensitive detection methods is required for the detection of these environmental chemicals. The aim of this work was the development and validation of two new bioanalytical assays to determine the biological potential of EDCs with high reliability. The first in vitro bioassay, the new Arxula adeninivorans yeast androgen screen (A-YAS), allows the detection of (anti) androgenic activities of EDCs as pure substances and in environmental samples. The A-YAS assay is based on transgenic A. adeninivorans cells, which constitutively express the gene of the human androgen receptor (hAR). The inducible gene of the reporter protein phytase K (phyK, derived from Klebsiella sp. ASR1) is under the control of the Arxula-derived glucoamylase (GAA) promoter, which was modified by the insertion of hormone responsive elements (HRE). In the presence of (anti) androgenic active substances, a dimer of the hAR ligand complex binds to the HRE sequences and regulates the reporter gene expression resulting in the secretion of the reporter protein, phytase K, into the medium. The recombinant enzyme activity, which correlates with the concentration of (anti) androgenic active substances, is photometrically detected as a measure of the absorption of phytase K. The Xplor®2 transformation/expression platform was used to generate mitoticly stable and resistance marker free yeast transformants and suitable representatives were selected as bio-components for the assay. The A-YAS assay is easy-to-use, fast (incubation times between 5 h and 24 h) and applicable for a high-throughput screening method in 96 well microtiter plate format. The median effective concentration (EC50) for the reference substance 5α-dihydrotestosterone was 277.1 ng L-1, with limits of detection and quantification of 56.5 ng L-1 and 76.5 ng L-1, respectively. Thus, the A-YAS assay is currently the most sensitive yeast-based assay for the detection of androgenic activity. Moreover, the androgenic and antiandrogenic activities of various other EDCs, such as naturally occurring androgens and estrogens, pharmaceuticals and biocides, were determined. The A-YAS assay represents a robust test system and can be used to determine the androgenic equivalent values (AEQs) of complex environmental samples such as urine. The AEQs of bovine urine samples determined by the bioassay were comparable with the AEQs determined by GC-MS analysis. The second test system developed in this study is a cell-free method, which enables the receptor-selective enrichment and detection of estrogenic and androgenic substances. Both, the complete encoding gene sequences and the sequence for the ligand binding domain (LBD) of human estrogen receptor α (hERα) and hAR were fused with the DNA sequence encoding a polyhistidine tag (His tag). The selection of suitable expression systems enabled the production of recombinant receptor proteins fused at N and C terminus to a His tag in four different host organisms, the bacterium Escherichia coli BL21(DE3), the yeasts Hansenula polymorpha and A. adeninivorans, and the plant Nicotiana benthamiana. For the maximum accumulation of recombinant protein, the cultivation parameters of the individual organisms were optimized. After cell disruption the purification of extracted proteins was performed by the metal-affinity interaction of His tagged fusion proteins with Ni(II) nitrilotriacetate (Ni-NTA) groups in the immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). LBD of hERα fused at C terminus to a His tag (LBD-hERα-6Hp) was synthesized in E. coli BL21(DE3)/pET-23a(+)-LBD-hERα. LBD-hERα-6Hp purificates were of high purity (>90 %) and highly concentrated (up to 4 mg mL-1). The application of different ligand binding assays demonstrated the functionality of the recombinant protein. Immobilization on a chip surface and integration into a flow cell allowed LBD-hERα-6Hp to be used in an enrichment process, which leads to detectable concentrations of previously indeterminable analytes. The specific binding of 17β-estradiol (17β-E2) was determined by specific recovery rates of 17β-E2 in the estrogen sensitive nAES-P assay (Kaiser et al., 2010), which decreased in the flow cell after incubation. In this work a competitive detection method has been developed by integration of an optical measuring method (luminescence). The specific binding of 17β-E2 was shown using the recombinant protein LBD-hERα-6Hp. The detection method can be used for the sensitive determination of hormonal activities of EDCs as pure substances and in environmental samples. Finally, the enrichment procedure could function as a preliminary test in preparation for more elaborate and expensive detection methods such as GC-MS analysis.

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Metadaten
Author: Torsten Gerlach
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002167-4
Title Additional (English):Development of new test systems for the detection of estrogenic and androgenic effects in the context of environmental analysis
Advisor:Prof. Dr. Gotthard Kunze
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/03/04
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/02/12
Release Date:2015/03/04
Tag:Arxula adeninivorans yeast androgen screen Assay (A-YAS Assay), Endokrine Disruptoren, Ligandenbindungsdomäne, in vitro Bioassay
Arxula adeninivorans yeast androgen screen assay (A-YAS assay), endocrine disrupting chemicals, in vitro bioassay, ligand binding domain
GND Keyword:Anreicherung, Arxula adeninivorans, Biosensor, Endokrin wirksamer Stoff, Escherichia coli, Hormonrezeptor, Phytase, Rekombinantes Protein
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology