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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002127-7

Characterization of complexes between platelet factor 4 and heparin

  • Heparin is an anticoagulant drug. It is important in the treatment of deep vein thrombosis,pulmonary embolism and during surgeries. Heparin-induced thrombocytopenia (HIT) is a severe adverse reaction caused by the formation of ultralarge complexes of platelet factor 4 (PF4) with unfractionated heparin (UFH). It can lead to limb loss or fatal events like stroke, myocardial infarction or pulmonary embolism. HIT has an incidence of about 3% in patients receiving anticoagulative heparin treatment. PF4 is a tetrameric protein, released from the α-granules of platelets upon activation. PF4 is known to form antigenic complexes with UFH accompanied by structural changes of PF4. In this thesis, the size and size distribution of PF4 and PF4/heparin complexes were analyzed using asymmetrical flow field-flow-fractionation (AF4), photon correlation spectroscopy (PCS) and atomic force microscopy (AFM). PF4 tends to form auto-aggregates and to adsorb to different surfaces, including regenerated cellulose, polyethersulfone, quartz and glass. The aggregates are less pronounced in solutions at isotonic NaCl concentration. Arginine and Tween 20 were identified as possible ingredients to hinder the auto-aggregation of PF4. Also, it is shown by combining circular dichroism (CD) spectroscopy, atomic force microscopy (AFM) and isothermal titration calorimetry (ITC) with UFH and defined chain length (16-, 8-, 6-, 5-mer) heparins that structural changes (i.e., increase in β-sheets) alone are not sufficient to induce antigenicity. While UFH, 16-, 8-, and 6-mer heparins all induced an increase in the antiparallel β-sheet content to > 30% (as determined by CD spectroscopy), complex antigenicity as measured by anti-PF4/heparin antibody binding in an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) was only induced by UFH and 16-mer heparin. Fondaparinux (5-mer heparin), which forms in vitro non-antigenic complexes with PF4, did not induce structural changes of PF4. Interestingly, the structural changes induced by antigenic UFH and 16-mer heparin but not by non-antigenic shorter heparins were reversible at higher heparin concentrations. Furthermore, the complexes formed by PF4 with longer heparins were larger than those formed with shorter heparins as shown by atomic force microscopy (AFM). UFH, HO16 and HO08 are able to form ultralarge multimolecular complexes with PF4. ITC data indicated strong electrostatic interactions and energetically unfavorable conformational changes of PF4 with longer heparins, while for the short heparins, favorable conformational changes in the structure of PF4 are induced. This explains the reversibility of the structural changes seen for UFH and HO16 upon addition of an over-saturating amount of heparin. Finally, using differential scanning calorimetry (DSC) the thermal stability of PF4 and PF4/heparin complexes was assessed. Despite its tendency to form auto-aggregates, PF4 is a heat-stable protein. This stability is, length dependently, even increased in complex with heparins. This work shows important differences in the binding between PF4 and heparins of different chain length and might be relevant for the understanding of other biological functions of heparins (e.g., involvement in allergic and inflammatory reactions).
  • Heparin ist ein gerinnungshemmendes Medikament. Es ist bei der Behandlung von tiefer Venenthrombose, Lungenembolie und bei Operationen wichtig. Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) ist eine schwere Nebenwirkung, die durch die Bildung von multimolekularen Komplexen von Plättchenfaktor 4 (PF4) mit unfraktionierten Heparinen (UFH) verursacht wird. Es kann zum Verlust von Gliedmaßen oder tödlichen Ereignissen wie Schlaganfall, Herzinfarkt oder Lungenembolie führen. HIT hat eine Inzidenz von etwa 3% bei Patienten unter Antikoagulation mit Heparin. PF4 ist ein tetrameres Protein, aus den α-Granula der Blutplättchen. Es ist bekannt, dass PF4 antigene Komplexe mit UFH bildet, begleitet von strukturellen Veränderungen des PF4. In dieser Arbeit wurden die Größe und Größenverteilung des PF4 und der PF4 / Heparin-Komplexe mit asymmetrischer Fluss Feld-Fluss-Fraktionierung (AF4), Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) und Rasterkraftmikroskopie (AFM) analysiert. PF4 neigt dazu, Auto-Aggregate zu bilden und auf verschiedenen Oberflächen, einschließlich regenerierter Cellulose, Polyethersulfon, Quarz und Glas zu adsorbieren. Die Aggregate sind weniger ausgeprägt in Lösungen bei isotonischer NaCl-Konzentration. Arginin und Tween 20 wurden als mögliche Bestandteile identifiziert, um die Auto-Aggregation von PF4 zu reduzieren. Auch wird durch Kombination von Circulardichroismus (CD) Spektroskopie, Atomkraftmikroskopie (AFM) und isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) mit UFH und Heparinen definierter Kettenlänge (16-, 8-, 6-, 5-mer) gezeigt dass strukturelle Veränderungen (das heißt, Zunahme der β- Faltblätter) allein nicht ausreichen, um die Antigenität zu induzieren. Während UFH, 16-, 8- und 6-mer Heparine alle eine Zunahme der antiparallelen β-Faltblatt-Gehalt > 30% induzieren, wird Antigenität nur von UFH und 16-mer Heparin induziert. Fondaparinux welches in vitro keine antigenen Komplexe mit PF4 bildet, induzierte keine Strukturveränderungen des PF4. Interessanterweise waren die strukturellen Veränderungen von Antigen UFH und 16- mer Heparin, aber nicht durch nicht-antige kürzere Heparine reversibel bei höheren Heparinkonzentrationen. ITC Daten zeigen starke elektrostatische Wechselwirkungen und energetisch ungünstige Konformationsänderungen von PF4 mit längeren Heparinen, während für die kurzen Heparine günstige Konformationsänderungen in der Struktur des PF4 induziert werden. Dies erklärt die Reversibilität der strukturellen Änderungen mit UFH und HO16 bei Zugabe einer übersättigenden Menge Heparin. Schließlich wurde unter Verwendung der dynamischen Differenzkalorimetrie (DSC), die thermische Stabilität von PF4 und PF4 / Heparin-Komplexen beurteilt. Trotz der Neigung zur Bildung von Autoaggregaten ist PF4 ein hitzestabiles Protein. Diese Stabilität ist längenabhängig im Komplex mit Heparin erhöht. Diese Arbeit zeigt wichtige Unterschiede in der Bindung zwischen PF4 und Heparinen unterschiedlicher Kettenlänge und könnte für das Verständnis von anderen biologischen Funktionen von Heparinen (z.B. Beteiligung an allergischen und entzündlichen Reaktionen) von Bedeutung sein.

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Metadaten
Author: Martin Kreimann
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002127-7
Title Additional (German):Charakterisierung von Komplexen zwischen den Plättchenfaktor 4 und Heparin
Advisor:Prof. Dr. Werner Weitschies
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2015/01/27
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/01/16
Release Date:2015/01/27
Tag:Heparin-induzierte Thrombozytopenie, Konformationsänderungen, Plättchenfaktor 4, isotherme Titrationskalorimetrie
GND Keyword:Antigenität, CD-Spektroskopie, Entropie, Heparin, Rasterkraftmikroskopie
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie