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Alexander Rabe

• Hintergrundinformationen: Bakterien gehören zu den ältesten Lebensformen und sind ein elementarer Bestandteil aller ökologischen Lebensräume auf der Erde. Der Mensch als Holobiont ist ein eigenständiges Ökosystem mit einer Vielzahl von ökologischen Nischen und einer großen bakteriellen Vielfalt. Durch innere oder äußere Einflüsse kann es zu Veränderungen der Umweltbedingungen kommen, die eine veränderte Zusammensetzung des Mikrobioms zur Folge haben. Eine solche Dysbiose wirkt sich auf den Gesundheitszustand des Menschen aus und kann zu schweren Krankheiten führen. Das orale Mikrobiom gehört mit zu den komplexesten Mikrobiomen des Menschen. Es bildet eine natürliche Barriere gegen Krankheitserreger und beugt somit u.a. lokalen Krankheiten wie Karies oder Parodontitis vor. Die Metaproteomik ermöglicht es, die exprimierten Proteine des Mikrobioms und deren Interaktion mit dem Wirt zu untersuchen. Diese Technologie überwindet somit die Beschränkung auf Laborkulturen und ermöglicht die Untersuchung des Mikrobioms direkt in seinem natürlichen Lebensraum. Die Metaproteomik bietet eine Reihe von Instrumenten zur Vertiefung des Verständnisses des oralen Mikrobioms hinsichtlich des Gesundheitszustandes des Menschen. Ziele: Ein Ziel dieser Dissertation war es einen Arbeitsablauf für die Durchführung von Metaproteomstudien des oralen Mikrobioms zu erarbeiten, beginnend bei der Probensammlung über die Präparation der Proben für die Massenspektrometrie bis hin zur bioinformatischen Auswertung. Diesen Arbeitsablauf galt es für das Mikrobiom des Speichels sowie für die Biofilme auf der Zunge und des supragingivalen Plaques zu etablieren bzw. zu adaptieren. Darauf aufbauend wurden Metaproteomstudien durchgeführt, um die drei Mikrobiome bei gesunden Probanden hinsichtlich ihrer exprimierten Proteine, deren metabolischer Bedeutung und Interaktionen mit dem Wirt sowie deren taxonomische Zuordnung zu studieren. Studiendesign: Die Dissertation umfasst drei Studien mit drei unterschiedlichen Kohorten. Allen Studien ist gemein, dass die Kohorten sich aus oral gesunden Probanden im Alter von 20-30 Jahren zusammensetzten. In der ersten Studie verglichen wir die Salivette® sowie den Paraffinkaugummi anhand von fünf Probanden, um die effektivste Methode zur Sammlung von Speichel für Metaproteomstudien zu identifizieren. In der zweiten Studie wurden die Mikrobiome von Speichel und Zunge anhand von 24 Probanden miteinander verglichen und dafür eine Auswertestrategie entwickelt, um der Komplexität dieser Metaproteomstudie gerecht zu werden. Im Rahmen unserer dritten randomisierten Einzelblindstudie, die auf einem Cross-over-Design basierte, erhielten 16 Probanden vier unterschiedliche lokale Behandlungsschemata, um deren Auswirkung auf das Plaque-Mikrobiom zu untersuchen. Die Behandlungen bestanden aus zwei Lutschtabletten, die Bestandteile des Lactoperoxidase-Systems in unterschiedlichen Konzentrationen enthielten, einer Lutschtablette mit einem Placebo-Wirkstoff sowie Listerine® Total Care™ Mundspülung als Positivkontrolle. Alle Proben wurden, basierend auf einem Bottom-Up-Ansatz, unter Verwendung von nano LC-MS/MS Massenspektrometern in einer datenabhängigen Messstrategie (DDA, data- dependant acquisition mode) vermessen. Die bioinformatische Auswertung erfolgte für die erste Studie mit Hilfe der Proteome Discoverer Software. Für die Studien zwei und drei wurde die Trans-Proteomic Pipeline eingesetzt. Die taxonomische sowie funktionelle Zuordnung der identifizierten Proteine erfolgte für alle Studien anhand der Prophane Software. Ergebnisse: Für den Paraffinkaugummi konnten wir mit 1.005 bakteriellen Metaproteinen dreimal so viele Metaproteine identifizieren im Vergleich zur Salivette® mit 313 Metaproteinen. 76,5 % der Metaproteine der Salivette® wurden ebenfalls mit dem Paraffinkaugummi gefunden. Insgesamt wurden 38 Genera und 90 Spezies identifiziert, wovon 13 Genera und 44 Spezies nur mit dem Paraffinkaugummi identifiziert werden konnten. Die größte funktionelle Diversität wurde ebenfalls mit dem Paraffinkaugummi detektiert. Das Metaproteom des Speichel- und Zungen-Mikrobioms basiert auf 3.969 bakteriellen Metaproteinen sowie 1.857 humanen Proteinen. Die Anzahl der nur für das Zungen-Mikrobiom identifizierten Metaproteine, war doppelt so hoch, im Vergleich zum Speichel. Die Metaproteine konnten 107 Genera sowie 7 Phyla zugeordnet werden. Funktionell wurden für das Speichel-Mikrobiom signifikant höhere Metaproteinabundanzen für die Zellmotilität gefunden. Beim Zungen-Mikrobiom hingegen wiesen die Metaproteine der Biosynthese von sekundären Metaboliten, Signaltransduktion oder der Replikation höhere Abundanzen auf. Im Rahmen der Plaque-Studie identifizierten wir durchschnittlich 1.916 (± 465) bakterielle Metaproteine je Probe, die wir taxonomisch und funktionell 116 Genera sowie 1.316 Proteinfunktionen zuordnen konnten. Die Plaque inhibierende Wirkung von Listerine® zeigte sich durch eine Reduktion der Metaproteinidentifikation von durchschnittlich 23,5 % nach der Behandlung. Darüber hinaus zeigte die Mehrheit der bakteriellen Metaproteine reduzierte relative Abundanzen während für die Metaproteine humanen Ursprungs eine Erhöhung der Proteinabundanzen gegenüber der Kontrolle vor Behandlung zu verzeichnen war. Aus funktioneller Sicht waren insbesondere metabolische Prozesse, welche für das Zellwachstum und die Zellteilung wichtig sind, betroffen. Im Gegensatz dazu erhöhten sich durch die LPO Lutschtabletten sowohl die Identifikation der Metaproteine als auch die relative Abundanz für die Mehrheit der Proteine. Nach den durch die Metaproteomdaten erhaltenen funktionellen Informationen liegen Hinweise für einen wachsenden Biofilm vor. Die Metaproteine, die eine erhöhte Abundanz nach Behandlung mit den LPO-Dragees zeigten, wurden taxonomisch hauptsächlich Erst- (S. gordonii) und Zweitbesiedlern (F. nucleatum) sowie Bakterien zugeordnet, die einem gesunden Biofilm zuträglich sind. Fazit: Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein vollständiger Metaproteom Arbeitsablauf von der Probensammlung, über die Probenpräparation bis hin zu Datenanalyse für das Speichel-, Zungen- und Plaque-Mikrobiom erarbeitet. In drei Studien konnten wir dessen Anwendbarkeit demonstrieren und erreichten vergleichbare Ergebnisse zu anderen Metaproteomstudien, beispielsweise bezüglich der Proteinidentifikation. Für die Sammlung von Speichelproben stellte sich der Paraffinkaugummi für Metaproteomstudien als die Methode der Wahl heraus. Für das Zungen-Mikrobiom veröffentlichten wir die ersten Metaproteomdaten. Darüber hinaus publizierten wir die erste Metaproteomstudie, welche die beiden Mikrobiome von Speichel und Zunge miteinander vergleicht. Hinsichtlich des Plaque-Mikrobioms handelte es sich ebenfalls um die erste Metaproteomstudie, die ein anerkanntes und etabliertes zahnklinisches Modell mit den Vorzügen der Metaproteomiks verbindet. Die Ergebnisse liefern erste Daten, um (auf längere Sicht gesehen) ein Produkt zur täglichen Mundhygiene entwickeln zu können, welches die bakterielle Zusammensetzung des Plaque-Biofilms positiv beeinflusst.
• Background: Bacteria are one of the oldest life forms and an elementary component of all ecological habitats on earth. Humans as holobionts are an ecosystem on their own with a wide range of ecological niches and great bacterial diversity. Internal or external influences can cause changes in environmental conditions, which result in a changed microbiome composition. This dysbiosis affects the health status of humans and can lead to serious diseases. The oral microbiome is one of the most complex microbiomes in humans. It forms a natural barrier against pathogens and can support prevention of diseases such as caries or periodontitis. Metaproteomics enables the study of the expressed proteins of the microbiome and their interaction with the host. This technology thus overcomes the limitations of not being limited to laboratory cultures, but to study the microbiome directly in its natural habitat. Metaproteomics offers a set of tools to deepen the understanding of the oral microbiome in health and disease. Objective: One aim of this dissertation was to develop a workflow to perform metaproteomic studies of the oral microbiome, from sample collection to preparation of samples for mass spectrometry and their bioinformatic analysis. This workflow aimed to should be established and adapted for the analysis of microbiomes of saliva as well as the biofilms of tongue and supragingival plaque. Based on these results, proof-of-principle metaproteomic studies were performed to study the three microbiomes in healthy volunteers regarding their expressed proteins, their metabolic relevance, and their interactions with the host as well as their taxonomic assignment. Study Design: The dissertation includes three studies with three different cohorts. All studies have in common that the cohorts consisted of orally healthy subjects aged 20-30 years. In the first study, we compared Salivette® as well as paraffin gum based on five subjects to determine the most effective method of collecting saliva for metaproteomic studies. In the second study, we compared the saliva and tongue microbiomes using 24 subjects and established a data analysis strategy for this more complex metaproteomic study. In our third single-blind randomized trial, based on a cross-over design, 16 subjects received four local treatment schemes to investigate their effect on the plaque microbiome. The treatments consisted of two lozenges containing components of the lactoperoxidase system at different concentrations, one lozenge containing a placebo, and Listerine® Total Care™ mouthwash as a positive control. All samples were measured, based on a bottom-up approach, using nano LC-MS/MS mass spectrometers in data-dependent acquisition mode. Bioinformatic analysis was performed for study one using the Proteome Discoverer software. For the studies two and three, the Trans-Proteomic Pipeline was applied. Taxonomic as well as functional assignment of the identified proteins was performed for all studies using the Prophane software. Results: For the paraffin gum, we were able to identify three times as many metaproteins with 1,005 metaproteins compared to the Salivette® with 313 metaproteins. 76.5% of the metaproteins of the Salivette® were also found with the paraffin gum. A total of 38 genera and 90 species were identified, of which 13 genera and 44 species were identified exclusively with the paraffin gum. The greatest functional diversity was also detected with the paraffin gum. The metaproteome of the salivary and tongue microbiome is based on 3,969 bacterial metaproteins and 1,857 human proteins. The number of metaproteins exclusively identified for the tongue microbiome, was twice as high compared to saliva. The metaproteins could be assigned to 107 genera as well as seven phyla. Functionally, significantly higher metaprotein abundances were found for the salivary microbiome for cell motility. Regarding the tongue microbiome, the metaproteins of biosynthesis of secondary metabolites, signal transduction or replication showed higher abundances. In the plaque study, we identified on average 1,916 (± 465) bacterial metaproteins per sample, which we were able to assign taxonomically and functionally to 116 genera and 1,316 protein functions. The plaque inhibitory effect of Listerine was revealed by a reduction in metaprotein identification of 23.5% on average after treatment. In addition, the majority of bacterial metaproteins showed reduced relative abundances while for the metaproteins of human origin an increase in protein abundances was observed compared to the control before treatment. From a functional point of view, metabolic processes for cell growth and division, were particularly affected. In contrast, for the LPO lozenges, both metaprotein identification and relative abundance increased for most proteins. According to the functional information obtained by the metaproteomic data, a growing biofilm can be assumed here. The metaproteins that showed increased abundance after treatment with the LPO lozenges were taxonomically assigned mainly to first (S. gordonii) and second colonizers (F. nucleatum) as well as bacteria that, according to current knowledge, are conducive to a healthy biofilm. Conclusion: In the context of this dissertation, a complete metaproteome workflow from sample collection, sample preparation to data analysis for the salivary, tongue and dental plaque microbiome was established. In three studies we were able to demonstrate its applicability and achieved comparable results, for example regarding protein identification, to other metaproteome studies. For the collection of saliva samples, the paraffin gum for metaproteomic studies was the method of choice. For the tongue microbiome, we published the first metaproteome data. In addition, we published the first metaproteome study comparing the two microbiomes of saliva and tongue. Regarding the plaque microbiome, this is the first metaproteomic study that combines a recognized and established dental clinical model with the advantages of metaproteomics. The results provide initial data to develop, as a long-term goal, a daily oral hygiene product to positively influence the bacterial composition of the plaque biofilm.