Open Access

Andrea Rebecca Kunze

• Im septischen Schock wird zur Kreislaufstabilisierung neben Katecholaminen auch Vasopressin eingesetzt. Aus dem Tiermodell ist bekannt, dass die selektive AVPR1a Stimulation der unspezifischen AVPR-Stimulation durch Vasopressin bezüglich des Outcomes und der Hämodynamik überlegen ist. Die Rolle der Vasopressinrezeptoren und die molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit dem Kapillarleck sind aber noch weitestgehend unerforscht. Bekannt ist, dass es bei Stimulation des AVPR2 durch Desmopressin zu einer Ausschüttung von vWF aus den Weibel-Palade-Bodies in vivo kommt. Die Weibel-Palade-Bodies enthalten unter anderen auch Ang-2, welches bei septischen Patienten im Blut erhöht ist und mit anderen inflammatorischen Werten, wie dem CRP und dem TNF-alpha korreliert. Auch für andere Inhaltsstoffe in den Weibel-Palade-Bodies beispielsweise P-Selektin ist dies nachgewiesen. Daraus resultiert die Frage, welchen Einfluss Vasopressin auf die Ausschüttung kapillär destabilisierender Mediatoren hat und weiterführend auch auf die Ausbildung eines Kapillarlecks. Ziel dieser Arbeit war es, ein Zellkulturmodell zur Untersuchung von AVPR1a und AVPR2- Agonisten und -Antagonisten bezüglich ihrer Ausschüttung von vWF, Ang-1, Ang-2 und P-Selektin zu entwickeln und ihre Auswirkung auf das Kapillarleck in vivo zu analysieren. HUVEC, HDMEC und HPMEC, primäre endotheliale mikrovaskuläre Zellen, wurden mittels Immunfluoreszenz, Western-Blot, FACS und rtPCR auf die Expression von AVPR1a, AVPR2 und vWF untersucht. Primär musste verifiziert werden, dass es bei Stimulation von AVPR2 durch Desmopressin in diesem Modell zu einer Ausschüttung von vWF aus Weibel-Palade-Bodies kommt. Hierzu wurde ein Protokoll erarbeitet, mit welchem anschließend die Ausschüttung von anderen Mediatoren mittels ELISA analysiert werden konnte. Außerdem der Trans-Well- Assays etabliert und analysiert mit der Frage, ob diese Methode mittels TEER und Durchlässigkeit für FITC-Albumin zur In-vitro-Untersuchung der Wirkung von Desmopressin auf einen endothelialen Monolayer geeignet ist. Entgegen den Beschreibungen in der Literatur konnte HUVEC nicht als Kontrollzelllinie genutzt werden, da sie, wie mittels Immunfluoreszenz, Western-Blot und rtPCR nachgewiesen wurde, genauso wie HDMEC und HPMEC sowohl AVPR1, als auch AVPR 2 exprimieren. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass HPMEC aufgrund seiner geringen Grundproduktion an vWF nicht als Zelllinie zur Untersuchung der Ausschüttung von vWF geeignet sind. In Etablierungsversuchen konnte herausgefunden werden, dass es nach 10-minütiger Inkubation mit 1000 nM Desmopressin in KRBP zu einem Anstieg von vWF und Ang-2 im Überstand kam, während Ang-1 und P-Selektin unverändert niedrig blieben. Vorausgehend mussten andere Inkubationszeiträume, andere Inkubationsmedien und Inkubationswells getestet werden. Im Verlauf zeigte sich das Arbeiten mit primären Zellen bezüglich der Reproduzierbarkeit unbeständig. Auch konnten keine Effekte durch Vasopressin, POV oder Tolvaptan dargestellt werden. Bei der Etablierung des Trans-Well-Assay zeigte sich die Wachstumskontrolle mittels TEER nicht geeignet. Die Versuchsdurchführung mit Desmopressininkubation des endothelialen Monolayers im Trans-Well unterlag sowohl in der TEER Messung als auch bezüglich der Durchlässigkeit für FITC-Albumin vielen Schwankungen, und es konnten keine validen Ergebnisse erzielt werden. Der Trans-Well-Assay kann als Untersuchungsmethode in diesem Set-up nicht empfohlen werden. Da die Versuchsergebnisse sehr variierten, gilt es diese im Verlauf zu minimieren. Hierzu wäre ein Modell, welches eine kontinuierliche Messung möglich macht von Vorteil. Auch scheint die Ausbildung von AVPR1a und AVPR2, sowie die Synthese von vWF und anderer Bestandteile der Weibel-Palade-Bodies starken Schwankungen zu unterliegen, hier könnten transfizierte, immortalisierte Zellen für mehr Stabilität sorgen, allerdings würde dies auch eine Entfernung zu in vivo Bedingungen bedeuten.
• In the setting of septic shock, vasopressin is administered alongside catecholamines for circulatory stabilization. Animal models have revealed that selective AVPR1a stimulation surpasses non-specific AVPR stimulation by vasopressin in terms of both outcome and hemodynamics. However, the roles of vasopressin receptors and the molecular mechanisms associated with capillary leakage remain largely unexplored. Stimulation of AVPR2 by Desmopressin has been observed to result in the release of von Willebrand Factor (vWF) from Weibel-Palade-Bodies in vivo. These bodies also contain Ang-2, elevated in the blood of septic patients, correlating with inflammatory markers such as CRP and TNF-alpha, as demonstrated for other Weibel-Palade-Body components, including P-selectin. This prompts the question of vasopressin's influence on the release of capillary destabilizing mediators and, consequently, the development of capillary leakage. The aim of this study was to develop a cell culture model to investigate AVPR1a and AVPR2 agonists and antagonists regarding their release of vWF, Ang-1, Ang-2, and P-selectin and to analyze their impact on capillary leakage in vivo. HUVEC, HDMEC, and HPMEC, primary endothelial microvascular cells, were examined for the expression of AVPR1a, AVPR2, and vWF using immunofluorescence, Western-Blot, FACS, and rtPCR. Verification of AVPR2 stimulation leading to vWF release from Weibel-Palade-Bodies in this model was pivotal. To achieve this, a protocol was devised to subsequently analyze the release of other mediators using ELISA. Additionally, the Trans-Well-Assay was established and evaluated to determine its suitability for in vitro examination of Desmopressin's effect on an endothelial monolayer using Transendothelial Electrical Resistance (TEER) and permeability to FITC-labeled albumin. Contrary to literature descriptions, HUVEC could not serve as a suitable control cell line, as demonstrated by immunofluorescence, Western-Blot, and rtPCR, revealing the expression of both AVPR1a and AVPR2, akin to HDMEC and HPMEC. Furthermore, it was demonstrated that HPMEC, due to their low basal production of vWF, were unsuitable for investigating vWF release. Establishment experiments revealed that a 10-minute incubation with 1000 nM Desmopressin in KRBP led to an increase in vWF and Ang-2 in the supernatant, while Ang-1 and P-selectin remained consistently low. Prior testing encompassed various incubation periods, media, and wells. The use of primary cells proved inconsistent in terms of reproducibility, and no discernible effects of vasopressin, POV, or Tolvaptan were demonstrated. During the establishment of the Trans-Well assay, growth control using TEER was deemed unsuitable. The experimental procedure involving Desmopressin incubation of the endothelial monolayer in the Trans-Well-Assay exhibited substantial fluctuations in both TEER measurement and permeability to FITC-labeled albumin, precluding the acquisition of valid results. Consequently, the Trans-Well-Assay is not recommended as a testing method in this setup. Given the considerable variability in test results, minimizing these variations over time is imperative. To address this, a model enabling continuous measurement would be advantageous. The synthesis of AVPR1a and AVPR2, as well as the production of vWF and other components within the Weibel-Palade-Bodies, appears to be subject to significant fluctuations. In this context, transfected, immortalized cells could potentially provide more stability, albeit at the cost of a departure from in vivo conditions.