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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002500-4

Die Funktion des MRP4 (ABCC4)-Transporters in Thrombozyten: Bedeutung von Adaptorproteinen

  • Das Multidrug Resistance Protein 4 (MRP4/ABCC4) ist als Mitglied der ABC-Transporterfamilie nicht nur an dem Transport zahlreicher Pharmaka, wie beispielsweise antiviraler und zytostatischer Substanzen, sondern auch an Signaltransduktionsprozessen, z.B. dem Transport von Eicosanoiden und zyklischen Nukleotiden beteiligt. MRP4 weist außerdem innerhalb der ABCC-Gruppe ein einmaliges Expression-, Lokalisations- und Substratspektrum auf. MRP4 wurde neben Prostata, Niere, Gehirn und Leber auch in Blutplättchen nachgewiesen und kann zelltypabhängig sowohl apikal oder basolateral als auch intrazellulär lokalisiert sein. Insbesondere das Vorkommen in den δ-Granula der Thrombozyten ist bemerkenswert, da die Speicherung und Freisetzung von Überträgersubstanzen wie ADP auf die Thrombozytenfunktion entscheidenden Einfluss haben. Änderungen der zelltypischen MRP4-Lokalisation, die beispielsweise bei Patienten mit δ-storage pool Defekt beobachtet wurden, können zu einem Verlust der spezifischen Transporterfunktion führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Transportprotein Multidrug resistance protein 4 in Bezug auf Protein-Protein-Wechselwirkungen genauer zu untersuchen. Da die Lokalisation von Membranproteinen u.a. durch die Wechselwirkung mit Proteinen gesteuert wird, stand die Identifikation möglicher Interaktionspartner von MRP4 mit Hilfe von Bindungs- und Kolokalisationsstudien im Vordergrund dieser Arbeit. Es schien sehr wahrscheinlich, dass Adaptormoleküle über eine Wechselwirkung mit MRP4 an dessen trafficking innerhalb der Zellen beteiligt sind und damit Einfluss auf dessen Lokalisation und konsekutiv auch auf die Funktion nehmen. Als mögliche Motive zur Vermittlung solcher Proteinbindungen liegen im MRP4-Molekül ein PDZ-Motiv sowie eine mögliche Bindungsstelle für Adaptorprotein (AP)-Komplexe vor. Zur Ermittlung solcher potentiellen Partner wurde eine Affinitätschromatographie durchgeführt. Dafür erfolgte die Kopplung eines Peptids, welches der C-terminalen Sequenz von MRP4 mit dem PDZ-Bindemotiv entsprach, an eine Sepharosematrix und eine anschließende Inkubation mit Thrombozytenlysat. Mittels Western Blot-Verfahren und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie konnten im gewonnenen Eluat das ERM-bindende Phosphoprotein 50 (EBP50/NHERF1), Moesin, sowie das Post synaptic density protein 95 (PSD95) und das Hitzeschockprotein Hsp90 als mögliche Bindungspartner identifiziert werden. Während eine Wechselwirkung von MRP4 mit EBP50 über seine PDZ-Domäne bereits postuliert worden war, konnten insbesondere PSD95 und Hsp90 erstmalig als mögliche Interaktionspartner von MRP4 ermittelt werden. Da PSD95 bisher vorwiegend in neuronalen Zellen beschrieben wurde, wurde das Vorkommen dieses Proteins in Thrombozyten und der megakaryoblastischen Leukämiezelllinie M-07e auf RNA-Ebene untersucht und nachgewiesen. Damit konnte erstmals die Expression dieses scaffolding Proteins in Zellen der myeloischen Reihe gezeigt werden. Im Anschluss daran wurden Kofärbungen von MRP4 und den identifizierten Bindungspartnern durchgeführt. Die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie lieferte das Ergebnis einer zumindest partiellen Kolokalisation des Transporters mit Hsp90 – in Thrombozyten und M-07e-Zellen in intrazellulären Strukturen, in den Nierenepithelzellen LLC-PK1 und MDCKII in der Plasmamembran. Auch eine Kolokalisation von MRP4 mit PSD95 konnte in M-07e-Zellen und Thrombozyten beobachtet werden. Untersuchungen mit dem Hsp90-Hemmstoff Radicicol ergaben des Weiteren zum einen eine sichtbare Verringerung der MRP4-Expression im Western Blot nach der Inkubation, zum anderen auch eine Änderung der Lokalisation von Hsp90 und MRP4 in den verwendeten Nierenzelllinien nach intrazellulär. Ferner konnten funktionelle Transportversuche unter Verwendung von inside-out Thrombozytenmembranvesikeln einen Abfall der Aufnahme des radioaktiv markierten MRP4-Substrats cGMP in die Vesikel nach Behandlung mit Radicicol zeigen. Um den Einfluss von PSD95 auf die MRP4-Lokalisation zu untersuchen, wurde ein spezifischer knock-down von PSD95 mittels siRNA in M-07e-Zellen durchgeführt. Im Anschluss ergab sich in der Immunfluoreszenzmikroskopie eine deutliche Zunahme der MRP4-Lokalisation in der Plasmamembran. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit EBP50, Moesin, PSD95 und Hsp90 als mögliche Bindungspartner von MRP4 in Thrombozyten identifiziert werden. Es ist denkbar, dass Hsp90 als Hitzeschockprotein möglicherweise zu der Prozessierung und Stabilisierung von MRP4 beiträgt. Die Interaktion mit PSD95 hingegen scheint die Internalisierung des Transportproteins zu begünstigen. Die gewonnenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Protein-Protein-Interaktionen die Lokalisation und Funktion von MRP4 entscheidend beeinflussen.
  • The Multidrug Resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ABC-transporter family. It is not only involved in the transport of a number of drugs, such as antiviral and cytotoxic substances, but also in signal transduction processes, e.g. the transport of prostanoids and cyclic nucleotids. Among the C subgroup of ABC-transporters MRP4 possesses a uniquely broad pattern of expression, localisation and substrates transported. It was detected in prostate, kidney, brain, liver as well as in platelets and is expressed according to the specific cell type apically, basolaterally or even intracellulary. Especially its expression in platelets’ dense granules is noteworthy, as the storage and degranulation of mediators such as ADP are essential for platelet function. Changes in the location of MRP4, which can be seen in patients with δ-storage pool defects can lead to a loss of transporter function. The aim of this work was to examine the transport protein MRP4 concerning protein-protein interactions. As the localisation of membrane proteins is among others regulated by interaction with other proteins, the identification of possible partners by binding and colocalisation studies was the primary object of this study. It seemed likely, that adaptor molecules are involved in the trafficking of MRP4 and thereby influence its localization and consecutively its function. As possible binding motives MRP4 possesses a PDZ-motive and a possible interaction domain for adaptor protein complexes. To determine possible binding partners affinity chromatography was carried out. A short peptide of the MRP4 C-terminus was coupled to a sepharose matrix and afterwards incubated with platelet lysate. In the eluate ERM-binding phosphoprotein 50 (EBP50/NHERF1), Moesin, Post synaptic density protein 95 (PSD95) and Heat shock protein 90 (Hsp90) could be detected by using western blot and mass spectrometry analyses. A possible interaction of MRP4 with EBP50 has already been postulated. However, an interaction with PSD95 and Hsp90 was shown for the first time. Since PSD95 has until now only been described in neuronal structures, its expression in platelets and cells of megacaryoblastic origin was examined and proven on mRNA level. Afterwards, costaining of MRP4 and its possible binding partners was undertaken. Indirect immunofluorescence microscopy showed a colocalisation with Hsp90 in platelets and mecacaryoblastic cell line in intracellular compartments and in kidney derived cell lines in the plasma membrane. Likewise, a colocalisation of MRP4 and PSD95 could be seen in megacaryoblastic cells and platelets. Examinations using the Hsp90 inhibitor Radicicol showed a decrease in MRP4 expression in western bot analysis and a change in localisation of the transporter and Hsp90 in kidney cell lines to intracellular compartments. Moreover, a significant reduction of cGMP uptake into inside-out membrane vesicles of platelets could be detected after incubation with Radicicol in functional transport studies. To examine the influence of PSD95 on MRP4 localisation specific siRNA knock-down was carried out in a megacaryoblastic cell line. The following immunofluorescence revealed an increased expression of MRP4 in the plasma membrane. In conclusion, EBP50, Moesin, PSD95 and Hsp90 were detected as possible binding partners of MRP4 in platelets. It seems likely, that Hsp90 is involved in the processing and stabilization of MRP4. The interaction with PSD95 seems to lead to an internalization of the transport protein. The results point at an important influence of protein-protein interactions on the localization and function of MRP4.

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Metadaten
Author: Marie-Luise Kromrey
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002500-4
Title Additional (English):Functioning of MRP4 (ABCC4) Transporter in Platelets: Influence of Adaptor Proteins
Advisor:Dr. Gabriele Jedlitschky
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/04/25
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/04/19
Release Date:2016/04/25
Tag:ABCC4, Hsp90, MRP4, PSD95
GND Keyword:ABC-Transporter, Adaptorproteine, Thrombozyten
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pharmakologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit