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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001928-2

Cyanobacteria as source of new antifungals

  • In the search for new antifungal agents, this study dealt with the antimicrobial screening, extraction, isolation, structural elucidation as well as selective biological investigations of the isolated compounds. In addition, the impact of the culture conditions on growth and on biosynthesis of bioactive compounds was also studied. Besides, selective cyanobacteria were axenized and the taxonomy as well as the genetic relationship of axenic cyanobacteria that produced bioactive compounds with some other cyanobacteria was identified basing on the 16S rRNA gene sequences. 22 Vietnamese and 6 German cyanobacterial strains were screened for their antifungal activity using the agar diffusion assay. Among them, the MeOH/water extract from the biomass obtained from a laboratory culture of strain Bio 33, isolated from the Baltic Sea near Rügen Island, exhibited a specific antifungal activity against Candida maltosa and others human pathogenous fungi such as Candida albicans, Candida krusei, Aspergillus fumigatus, Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum and Mucor sp. Besides, it was very impressed that extracts of strain Bio 33 showed no antibacterial activity against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, and Staphylococcus aureus. The taxonomy basing on 16S rRNA gene sequence of the axenic Bio 33 identified this strain as Anabaena cylindrica species. As a result of the bioassay-guided fractionation of the crude MeOH/water extract, four new lipopeptides, named balticidins A – D, were isolated. These lipopeptides represent a new structural type with the co-occurrence of a glycosylated cyclic peptide, a fatty acid containing chlorine and a disaccharide moiety. The main active fraction isolated from the MeOH/water extract of the biomass of Bio 33 which contains the four lipopeptides exhibited only marginal cytotoxic activity against the human bladder carcinoma cell line 5637 (IC50 = 93 μg/ml). The weak cytotoxic activity and the absence of antibacterial effects in the used in vitro test systems opens a promising future for further investigations to clarify the antifungal mechanism and for in vivo applications of the new lipopeptides. Different media, temperature, light intensity and period of irradiance, the depletion of nitrate and the trace element cobalt were investigated to figure out conditions at which Bio 33 produces maximum of balticidins under laboratory conditions. Temperature was the most apparent factor influencing the growth of Bio 33 and the production of balticidins. Bio 33 grew best in BG 11 medium plus 0.5% NaCl at 26°C, under white fluorescent continuous light and a light intensity of 20 μmol photons m-2 s-1. Nevertheless, under the same conditions, 22.5°C was the best temperature for the production of balticidins. Besides, harvesting of Bio 33 during the logarithmic growth phase, particularly at 20th day, should supply approximately maximum quantity of balticidins. At 22.5°C and 20 μmol photons m-2 s-1 under 24 h continuous irradiance, the depletion of nitrate had no negative effect on the growth and concentration of balticidin A but increased balticidin B and decreased balticidin C; the absence of cobalt slightly decreased the growth but had no clear effect on the production of balticidins. On the other hand, extracts of the culture medium of the Vietnamese cyanobacterium TVN40, exhibited antifungal activity against Candida maltosa and weak antibacterial activity. Extraction of the culture medium with XAD-16 and elution of the XAD-bounded compounds by different solvents resulted in five fractions (water, 80% MeOH, 100% MeOH, acetone, dichloromethan). Four compounds have been isolated from the 80% MeOH fraction and one was identified as a dioxindole derivative. Structural elucidation of the other three compounds is still in progress. TVN40 was formerly identified as an Anabaena sp. according to the morphological properties, but the 16S rRNA gene sequence confirms that the strain belongs to the genus Nostoc. Microscopic examination of TVN40 revealed that the filamentous strain was not a unialgal but a mixed culture with strange round cells (SRCs) - a unicellular cyanobacterium belonging to the order Chroococcales. Laboratory cultures of the pure filamentous strain TVN40, the isolated SRCs and the mixed culture of both strains were established. Both TVN40 and SRC culture media were responsible for the antibacterial activity against B. subtilis, S. aureus and E. coli. However, only the extract of the culture medium of TVN40 was active against C. maltosa. The supplement of cobalt enhanced the antimicrobial activity of the culture medium. Pure strains showed higher activity in comparison to the mixed culture of TVN40 and SRC.
  • Auf der Suche nach neuen Antimykotika beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit dem antimikrobiellen Screening, der Extraktion, der Isolierung und Strukturaufklärung sowie mit selektiven biologischen Untersuchungen der isolierten Verbindungen. Zusätzlich wurde die Bedeutung der Kulturbedingungen auf Wachstum und die Synthese der Wirkstoffe untersucht. Ausgewählte Cyanobakterien wurden axenisiert und die verwandtschaftlichen Beziehungen der produzierenden Stämme zu anderen Cyanobakterien basierend auf 16S rRNA Gensequenzen identifiziert. 22 vietnamesische und 6 deutsche Cyanobakterienstämme wurden unter Verwendung des Agardiffusionstests auf antifungale Aktivität getestet. Dabei zeigte der MeOH/Wasser Extrakt aus der Biomasse der Laborkultur des Cyanobakterienstammes Bio 33, isoliert aus der Ostsee nahe Rügen, eine spezifische antifungale Aktivität gegen Candida maltosa und weitere humanpathogenen Pilzen z. B. Candida albicans, Candida krusei, Aspergillus fumigatus, Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum und Mucor sp. Außerdem war es sehr beeindruckend, dass die Extrakte von Bio 33 keine antibakterielle Aktivität gegen Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus zeigten. Taxonomische Untersuchungen basierend auf der 16S rRNA Gensequence axenischer Kulturen von Bio 33 identifizierten diesen Stamm als Anabaena cylindrica. Als Ergebnis der Bioassay geführten Fraktionierung des MEOH/Wasser Rohextrakts aus der Biomasse von Bio 33 wurden vier neue Lipopeptide, bezeichnet als Balticidine A – D, isoliert. Diese Lipopeptide stellen einen Strukturtyp dar, der gekennzeichnet ist durch das gleichzeitige Auftreten eines glykosylierten zyklischen Peptids, einer Chlor haltigen Fettsäure und einer Disaccharid-Einheit. Die Fraktion mit der höchsten Aktivität, die diese vier Lipopeptide enthielt, zeigte nur marginale zytotoxische Aktivität gegen die menschliche Blasenkarzinom-Zellinie 5637 (IC50 = 93 µg/mL); nur schwache zytotoxische Aktivität und das Fehlen antibakterieller Effekte in den verwendeten in vitro Testsystemen. Verschiedene Faktoren um die Bedingungen zu identifizieren, unter denen Bio 33 das Maximum an Balticidinen unter Laborbedingungen produziert. Die Temperatur war den stärksten Einfluss auf das Wachstum von Bio 33 und die Synthese der Balticidine ausübte. Das beste Wachstum wurde in BG 11 Medium plus 0,5% NaCl bei einer Temperatur von 26°C und weißem Dauerlicht (Fluoreszenzlampen) einer Lichtintensität von 20 µmol photons m-2 s-1 beobachtet. The Synthese der aktiven Verbindungen war jedoch bei 22,5°C bei ansonsten gleichen Bedingungen erhöht. Die maximale Ausbeute an Balticidinen sollte daher bei Ernte von Bio 33 in der logarithmischen Wachstumsphase, bevorzugt am 20. Tag, erzielt werden. Bei 22,5°C und Dauerlicht einer Intensität von 20 µmol photons m-2 s-1 hatte die Entfernung von Nitrat keinen negativen Effekt sowohl auf das Wachstum als auch auf die Konzentration von Balticidin A, steigerte jedoch die Menge an Balticidin B und verringerte die Ausbeute an Balticidin C. Die Abwesenheit von Kobalt reduzierte das Wachstum, hatte aber keinen deutlichen Effekt auf die Produktion der Balticidine. Auch die Extrakte des Kulturmediums des Vietnamesischen Cyanobakteriums TVN40 zeigten antifungale Aktivität gegen Candida maltosa sowie eine schwache antibakterielle Aktivität. Extraktion des Kultivierungsmediums mit Ethylacetat bzw. XAD-16 und Elution der XAD-gebundenen Komponenten durch verschiedene Lösungsmittel resultierte in fünf Fraktionen (Wasser, 80% MeOH, 100% MeOH, Aceton, Dichlormethan). Es wurden vier Verbindungen von der 80% MeOH Fraktion isoliert, eine wurde als Dioxindolderivat (3-hydroxy-2-oxo-2,3-dihydroindol-3-yl)acetonitrile identifiziert. Die Ergebnisse der Strukturaufklärung der drei weiteren Verbindungen stehen noch aus. Der Stamm TVN40 wurde ursprünglich aufgrund seiner morphologischen Eigenschaften als Anabaena sp. identifiziert, jedoch die Analyse seiner 16S rRNA Gensequence bestätigte seine Zugehörigkeit zur Gattung Nostoc. Die mikroskopische Untersuchungen zeigte, dass der filamentöse Stamm TVN40 nicht unialgal war, sondern eine Mischkultur mit „strange round cells“ (SRCs), einzelligen Cyanobakterien, die zu den Chroococcales gehören, ddarstellte. Laborkulturen des fädigen TVN40, der einzelligen SRCs sowie der Mischkultur von TVN40 und SRC wurden etabliert. Sowohl das Kulturmedium von TVN40 als auch der SRCs zeigte antibakterielle Aktivität gegen B. subtilis, S. aureus und E. coli. Allerdings war nur der Extrakt des Kulturmediums von TVN40 aktiv gegen C. maltosa. Der Zusatz von Cobalt steigerte die antimikrobielle Aktivität des Kulturmediums. Die Kulturmedien der unialgalen Stämme waren im Vergleich zur Mischkultur von TVN40 und SRCs stärker wirksam.

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Metadaten
Author: Thanh Huong Bui
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001928-2
Title Additional (German):Cyanobakterien als Quelle neuer Antimykotika
Advisor:Prof. Dr. Ulrike Lindequist, Dr. Sabine Mundt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2014/06/05
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/05/14
Release Date:2014/06/05
Tag:16S rRNA Gensequence, Axenization
Antifungals, Balticidin, Cyanbacteria, culture conditions, lipopeptide
GND Keyword:Antimykotika, Balticidin, Cyanobakterien, Dioxindolderivat, Kulturbedingungen, Strukturaufklärung, antimikrobiellen Screening, lipopeptide
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie