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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002943-3

Herstellung und Evaluierung eines zweifach attenuierten sowie eines dualen Influenza-A-Lebendimpfstoffkandidaten im Maus- und Schweinemodell

  • Trotz der Verfügbarkeit von verschiedenen Impfstoffen zählen Influenza-A-Viren (IAV) nach wie vor zu den gefährlichsten humanpathogenen Krankheitserregern weltweit. Ebenso verursachen einige animale IAV-Stämme bei zahlreichen Wild- und Nutztierarten schwerwiegende und teilweise tödlich verlaufende Infektionen. Daher ist die Entwicklung moderner und effektiver Impfstoffe gegen IAV für die Tier- und Humanmedizin von größter Wichtigkeit. Im ersten Teil der Arbeit wurde auf Basis des IAV-Stamms A/Bayern/74/2009 (pH1N1) eine doppelt-attenuierte IAV-Mutante, genannt BY74-NS1-99-E, mit einem Elastase-sensitiven HA-Spaltmotiv und einer C-terminalen Verkürzung des Interferon-Antagonisten NS1 generiert und hinsichtlich ihrer Eignung als IAV-Lebendimpfstoff untersucht. In vitro zeigte sich BY74-NS1-99-E streng Elastase-abhängig und replizierte ausschließlich unter dessen Zugabe zu ähnlich hohen Titern wie der Wildtyp unter Zugabe von Trypsin. Aufgrund der geringen Elastase-Verfügbarkeit in vivo war die Mutante in ihrer Replikationsfähigkeit stark eingeschränkt und zeigte sich im Gegensatz zum Wildtyp sowohl im Mausmodell als auch im Schwein vollkommen apathogen. In der Maus führte die einmalige intranasale Applikation von BY74-NS1-99-E zu einer deutlichen Bildung von H1-spezifischen Serumantikörpern. Ihr Auftreten korrelierte mit dem Schutz der Mäuse gegen eine Belastungsinfektion mit dem homologen Wildtyp-Virus. Während eine singuläre Immunisierung mit einer Dosis von 106 TCID50 BY74-NS1-99-E komplett vor einer Replikation des homologen Belastungsvirus schützte, verhinderten Dosen ab 104 TCID50 die Ausbildung klinischer Symptome, einen Gewichtverlust und reduzierten die pulmonale Viruslast. Im Schwein erwies sich die Mutante als wenig immuogen. So ließ sich selbst nach zweifacher intranasaler Applikation mit der Mutante keine H1- oder NP- spezifische Antikörper-Antwort nachweisen. Um künftig leichter Fragen zum Zelltropismus und zur Virusausbreitung auch in Echtzeit sowohl in vitro als auch in vivo untersuchen zu können, wurde im Rahmen des zweiten Teils der Arbeit ein replikationsfähiges IAV mit einem membranständigen eGFP generiert. Die Strategie zur Herstellung des rekombinanten, Fremdgen exprimierenden Virus, basierte auf einer Veröffentlichung von Gao et al. (2010), in welcher ein IAV mit einem zusätzlichen neunten Gen-Segment beschrieben wird. Bei den in vitro Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der mittels reverser Genetik hergestellten Mutante BY74-eGFP, wurde eine im Vergleich zum parentalen Wildtyp verminderte Replikationseffizienz festgestellt. Genetisch zeigte sich BY74-eGFP weitgehend stabil. Die Ergebnisse der Western-Blots sowie die Immunfärbungen zur konfokalmikroskopischen Auswertung deuteten stark auf eine Inkorporation des NA-eGFP-Fusionsproteins in die virale Membran der Mutante hin. Ein solches Reportergen-exprimierendes Virus könnte zukünftig als molekulares Werkzeug bei der Untersuchung und Aufklärung der genauen Verläufe einer IAV-Infektion in vitro und in vivo dienen. Ziel des dritten Teils dieser Arbeit war es, auf Grundlage der Arbeiten von Gao et al. (2010) und Stech et al. (2005), ein Elastase-abhängiges IAV, welches zwei verschiedene Hämagglutinine (H1 und H3) exprimiert, zu generieren und auf seine Eignung als LAIV im Mausmodell zu untersuchen. Als Basis für das generierte Neunsegmentvirus BY74-H1H3-E diente der Stamm A/Bayern/74/09 (pH1N1). Das zusätzlich bereitgestellte neunte Gensegment codierte für das H3-HA des Stammes A/Swine/Bissendorf/IDT1864/2003 (H3N2) (SB03). Bei den In-Vitro-Untersuchungen zur Expressions-Stabilität konnte zwar zunächst eine schwache H3-HA-Expression in den infizierten Zellen beobachtet werden, jedoch reduzierte sich diese von Passage zu Passage und verschwand letztendlich. Die Genomanalyse zeigte, dass das H3-tragende Gensegment letztlich verloren ging. Im Vergleich zum Wildtyp wies das potentielle Impfvirus in vitro eine stark verringerte Replikationsfähigkeit auf. Im Mausmodell erwies sich die BY74-H1H3-E-Mutante im Gegensatz zu A/Bayern/74/09 (pH1N1) und A/Swine/Bissendorf/IDT1864/2003 (H3N2) als vollkommen apathogen. Eine zweifache intranasale Immunisierung mit 103 TCID50 der dualen Virusmutante induzierte eine deutliche H1-spezifische und zum Teil eine moderate H3-spezifische Antikörper-Antwort. Sie schützte die Tiere bei einer homologen Belastungsinfektion BY74-Wildtyp (H1N1) komplett vor einem Gewichtsverlust und der Ausbildung klinischer Symptome. Bei einer heterosubtypischen Belastungsinfektion mit SB03-Wildtyp (H3N2) reduzierte sie den Gewichtsverlust und die klinischen Symptome. Die Doppelimmunisierung führte sowohl bei den Tieren, die einer homologen als auch bei den Tieren die einer heterologen Belastungsinfektion unterzogen worden waren zu einer Reduktion der pulmonalen Viruslast. Insgesamt erfüllte BY74-H1H3-E die Anforderungen eines potentiellen dualen LAIV-Kandidaten nur bedingt.
  • Despite the availability of various vaccines, influenza viruses remain one of the most dangerous pathogens for humans worldwide. Moreover, various wild and livestock animals are also susceptible to fatal influenza infections. For those reasons, the development of effective influenza vaccine for usage in veterinary and human medicine has remained a cruicial issue. In the first part of the present study, a double-attenuated strictly elastase-dependent mutant of SoIV A/Bayern/74/2009 (pH1N1) expressing a C-terminally truncated NS1 protein was generated by reverse genetics and tested for its applicability as live attenuated influenza vaccine (LAIV). To this end, the natural trypsin-sensitive motif of the haemagglutinin (HA) cleavage site was converted to an elastase-sensitive motiv. Additionally, the interferon antagonist NS1 was C-terminally truncated by introducing several stop codons followed by a C-terminal deletion. Only in the presence of elastase the mutant displayed similar growth properties like the wild-type virus BY74-rWT. Due to the insufficient availability of elastase in vivo, BY74-NS1-99-E was highly attenuated in mice and swine. Neither BY74-NS1-99-E-infected mice nor BY74-NS1-99-E-infected pigs developed clinical signs of influenza. In contrast to the PBS-immunized control group, a single intranasal vaccination of mice with BY74-NS1-99-E led to a substantial induction of HA-specific serum antibodies. An infection dosage of 104 TCID50 BY74-NS1-99-E provided notable protection from clinical symptoms and weight loss, whereas beyond that the highest dosage of 106 TCID50 BY74-NS1-99-E induced complete protection from viral replication in the lungs against homologous infection with BY74-rWT. In swine, a natural host for IAV, only a slight HA-specific serum antibody response could be detected in one of three pigs, which received a double intranasal BY74-NS1-99-E-vaccination. The second part of this thesis aimed to generate and characterize an IAV expressing a membrane-bound reporter gene, for usage as tool for the direct analysis of cell tropism and viral spread in vivo and in vitro. Based on the approach by Gao et al. (2010), a replication-competent IAV BY74-eGFP with an additional ninth gene-segment encoding for an NA-eGFP protein, was generated by exchanging the PB1-packaging sequences for those of the neuraminidase gene and flanking the NA-eGFP protein with the PB1 packaging sequences. To construct a membrane-anchored eGFP, the N-terminal part of NA including its transmembrane domain, was fused with an eGFP reporter gene. The mutant showed a reduced replication efficiency similar to the mutants by Gao et al. (2010). The observed eGFP-expression in BY74-eGFP-infected cells remained nearly stable for up to 10 subsequent cell passages. Both western blot and confocal fluorescence microscopy indicated the incorporation of the eGFP in BY74-eGFP particle. Such an IAV expressing a reporter gene could be easily used to monitor viral infection in vitro and in vivo. The third part of this study aimed to engineer an elastase-dependent IAV encoding two different HAs (H1 and H3) as a live attenuated bivalent influenza vaccine against H1N1 and H3N2 strains. To insert the foreign H3 HA gene into an IAV genome as nineth segment, we applied the same strategy as for BY74-eGFP. We successfully rescued a recombinant (BY74-H1H3-E) of the IAV strain A/Bayern/74/2009 (pH1N1) carrying the HA of A/Sw/Bissendorf/IDT1864/03 (H3N2) in addition. Furthermore, the HA cleavage sites of the both HA genes were replaced by a elastase motif (Stech et al., 2005). In contrast to the recombinant wild-type BY74-rWT (H1N1), the growth rate of BY74-H1H3-E in MDCK cells was impaired substantially. Unexpectedly, the nine-segmented genome of BY74-H1H3-E was not stable when serially passaged in vitro. Accordingly, after 10 cell passages, neither H3-HA expression nor the additional H3-encoding gene were detectable. Both HA proteins appeared to be incorporated into the viral envelope of the initial stock virus. Mice inoculated intranasally twice with 103 TCID50 BY74-H1H3-E developed a distinct H1-specific antibody response and a moderate H3-specific antibody response. For mice, BY74-H1-H3-E was completely non-pathogenic. Moreover, a two-dose immunization completely inhibited clinical symptoms and reduced the viral replication after homologous challenge with BY74-rWT (H1N1). Despite low expression of H3-HA in vitro, BY74-H1H3-E was able to offer some degree of cross-protection against the heterosubtypic strain A/Swine/Bissendorf/IDT1864/2003 (H3N2). Upon heterosubtypic challenge, the BY74-H1H3-E-vaccinated mice showed only mild clinical signs faster recovery than mock-vaccinated animals. Overall, we demonstrated that the elastase-dependent BY74-H1H3-E expressing a foreign H3-HA protein in addition elicited high and moderate levels of protection against clinical disease upon homo- and heterosubtypic challenge, respectively.

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Metadaten
Author: Robert Scheffter
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002943-3
Title Additional (English):Development and evaluation of a double-attenuated and a bivalent live vaccine against influenza A virus
Advisor:Dr. Jürgen Stech, Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2017/12/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/07/07
Release Date:2017/12/11
Tag:Bivalent
GND Keyword:Elastase, H1N1, H3N2, Hemagglutinin, Influenza-A-Virus, Lebendimpfstoff, NS1
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie