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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-35148

Absolute & relative membrane protein quantification - a mass spectrometry-based approach

  • Microbial cell factories have been largely exploited for the controlled production of recombinant proteins, including industrial enzymes and biopharmaceuticals. The advent of high-throughput ‘-omics’ techniques have boosted the design of these production systems due to their valuable contribution to the field of systems metabolic engineering, a discipline integrating metabolic engineering with systems and synthetic biology. In order to thrive, the field of systems metabolic engineering needs absolute proteomics data to be generated, as proteins are the central players in the complex metabolic and adaptational networks. Due to advent of mass spectrometry-based proteomics, a substantial amount of absolute proteomic data became available in the past decade. However, membrane proteins remained inaccessible to these efforts. Nonetheless, comparative studies targeting the membrane proteome have been quite successful in characterizing physiological processes. Hence, label-free proteomics was used in a study (Quesada-Ganuza et al, 2019 – Article I) to identify and optimize PrsA in Bacillus subtilis, for improved yield of amylase. Amylase is one of the most relevant enzymes in the biotechnological sector. By employing a label-free mass spectrometry approach targeting the membrane proteome of this bacterium, relative changes in heterologous and native levels of PrsA could be quantified. The results of this study evidenced that each PrsA shows different relative abundancies, but with no relevant impact in the yield of amylase. Even though relative protein quantification can already provide a good visualization of the physiological changes occurring between different conditions, they are not sufficient to understand how resources are allocated in the cell under certain physiological conditions. Therefore, a global method for absolute membrane protein quantification remains the biggest requirement for systems metabolic engineering. Hence, with this work, we successfully developed a mass spectrometry-based approach enabling the absolute quantification of membrane proteins (Antelo-Varela et al, 2019 – Article II). This study was also performed in the Gram-positive model organism Bacillus subtilis, regarded as a prolific microbial cell factory. The method developed in this work combines the comprehensiveness of shotgun proteomics with the sensitivity and accuracy of targeted mass spectrometry. Fundamental to the method is that it relies on the application of a correction and an enrichment factor to calibrate absolute membrane protein abundances derived from shotgun mass spectrometry. This has permitted, for the first time reported, the calculation of absolute membrane protein abundances in a living organism. The newly developed approach enabled to accurately quantify ~40% of the predicted proteome of this bacterium, offering a clear visualization of the physiological rearrangements occurring upon the onset of osmotic stress. In addition, this work also provides evidence for new membrane protein stoichiometries. Overall, this study enabled the development of a straightforward methodology long-needed in the scientific and biotechnological community and, for the first time reported, providing absolute abundances of one of the most puzzling fractions of the cell – the membrane proteome. The next step of the work summarized here was to implement the afore described method to a biotechnological relevant strain, as absolute membrane protein abundances are essential to understand the fundamental principles of protein secretion and production stress. Hence, this work was applied in a genome-reduced B. subtilis strain, ‘midiBacillus’, expressing the major staphylococcal antigen IsaA (Antelo-Varela et al, submitted – Article III). The employed absolute membrane protein quantification methodology enabled the analysis of physiological rearrangements occurring upon the induction of heterologous protein production. This work showed that, even though IsaA was successfully secreted into the growth medium, one of the main requirements for the biotechnological sector, it was still partly accumulated in the cell membrane of this bacterium. This led to an exacerbated physiological response where membrane proteins involved in the management of secretion stress were activated. In addition, this study also showed that a rearrangement of the cell’s translocation machinery occurs upon induction of production, where a ‘game’ of in- and decrease of transporters takes place. Anticipating the impact of genetic and environmental insults, such as the ones caused by production stress, is essential for the field of systems metabolic engineering. Thus, the highly accurate and comprehensive dataset generated during this work can be implemented in predictive mathematical models, thereby contributing in the rational design of next-generation secretion systems.
  • Mikrobielle Zellfabriken wurden weitgehend für die kontrollierte Produktion rekombinanter Proteine genutzt, einschließlich industrieller Enzyme und Biopharmazeutika. Das Aufkommen von Hochdurchsatz-"Omics"-Techniken hat das Design dieser Produktionssysteme aufgrund ihres wertvollen Beitrags zum Bereich der System-Metabolic-Engineering, einer Disziplin, die das Metabolic-Engineering mit Systembiologie und synthetischer Biologie verbindet, gefördert. Damit der Bereich System-Metabolic-Engineering florieren kann, müssen absolute Proteomicsdaten generiert werden, da Proteine die zentralen Akteure in den komplexen Stoffwechsel- und Anpassungsnetzwerken sind. Aufgrund des Aufkommens der massenspektrometrie-basierten Proteomik wurde in den letzten zehn Jahren eine beträchtliche Menge an absoluten Proteomdaten verfügbar. Membranproteine blieben für diese Bemühungen jedoch weiterhin kaum zugänglich. Nichtsdestotrotz waren vergleichende Studien, die auf das Membranproteom abzielten, bei der Charakterisierung physiologischer Prozesse recht erfolgreich. Daher wurde in einer Studie (Quesada-Ganuza et al., 2019 - Artikel I) die markierungsfreie Proteomanalyse verwendet, um PrsA in Bacillus subtilis zu identifizieren und zu optimieren, mit dem Ziel die Ausbeute an Amylase zu verbessern. Amylase ist eines der relevantesten Enzyme im biotechnologische Sektor. Durch Verwendung eines markierungsfreien Massenspektrometrie-Ansatzes, der auf das Membranproteom dieses Bakteriums abzielt, konnten relative Änderungen der heterologen und nativen PrsA-Spiegel quantifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass jedes PrsA unterschiedliche relative Häufigkeiten aufweist, jedoch keine relevanten Auswirkungen auf die Ausbeute an Amylase hat. Obwohl die relative Proteinquantifizierung bereits eine gute Darstellung der physiologischen Veränderungen, die zwischen verschiedenen Zuständen auftreten, liefern kann, reichen sie nicht aus, um zu verstehen, wie Ressourcen unter bestimmten physiologischen Bedingungen in der Zelle zugewiesen werden. Daher bleibt eine globale Methode zur absoluten Quantifizierung von Membranproteinen nach wie vor die größte Herausforderung für das System-Metabolic-Engineering. In dieser Arbeit wurde erfolgreich ein massenspektrometrischer Ansatz entwickelt, der die absolute Quantifizierung von Membranproteinen ermöglicht (Antelo-Varela et al., 2019 - Artikel II). Diese Studie wurde ebenfalls am grampositiven Modellorganismus Bacillus subtilis durchgeführt, der als eine produktive mikrobielle Zellfabrik angesehen wird. Die in dieser Arbeit entwickelte Methode kombiniert die Vollständigkeit der Shotgun-Proteomik mit der Empfindlichkeit und Genauigkeit der gezielten Massenspektrometrie. Grundlegend für das Verfahren ist, dass es auf der Anwendung eines Korrektur- und eines Anreicherungsfaktors beruht, um absolute Membranproteinhäufigkeiten zu kalibrieren, die aus der Shotgun-Massenspektrometrie stammen. Dies ermöglichte erstmals die Berechnung der absoluten Membranproteinhäufigkeit in einem lebenden Organismus. Der neu entwickelte Ansatz ermöglichte die genaue Quantifizierung von ~ 40% des vorhergesagten Proteoms dieses Bakteriums und ermöglichte die klare Darstellung der physiologischen Anpassungen, die beim Einsetzen von osmotischem Stress auftreten. Darüber hinaus liefert diese Arbeit Hinweise auf neue Membranproteinstöchiometrien. Insgesamt ermöglichte diese Studie die Entwicklung einer einfachen Methodik, die in der wissenschaftlichen und biotechnologischen Gemeinschaft seit langem benötigt wird und lieferte zum ersten Mal absolute Häufigkeiten einer der rätselhaftesten Fraktionen der Zelle - des Membranproteoms. Der nächste Schritt der hier zusammengefassten Arbeit war die Implementierung der oben beschriebenen Methode bei einem biotechnologisch relevanten Stamm, da die Bestimmung der absoluten Membranproteinhäufigkeiten enorm hilfreich für das Verständnis der Grundprinzipien der Proteinsekretion und des Produktionsstresses sein kann. Diese Methode wurde in einem genomreduzierten B. subtilis-Stamm, „midiBacillus“, angewendet, der das Hauptstaphylokokken-Antigen IsaA exprimiert (Antelo-Varela et al., Eingereicht - Artikel III). Die angewandte Methode zur absoluten Quantifizierung der Membranproteine ermöglichte die Analyse physiologischer Anpassungen, die nach Induktion der heterologen Proteinproduktion auftraten. Diese Arbeit zeigte, dass IsaA, obwohl es erfolgreich in das Wachstumsmedium sezerniert wurde, eine der Hauptanforderungen für den biotechnologischen Sektor, teilweise noch in der Zellmembran dieses Bakteriums akkumuliert war. Dies führte zu einer verstärkten physiologischen Reaktion, bei der Proteine aktiviert wurden, die am Management von Sekretionsstress beteiligt sind. Darüber hinaus zeigt diese Studie auch eine Neuordnung der Translokationsmaschinerie der Zelle, bei der ein "Spiel" des Ein- und Abbaus von Transportern stattfindet. Die Vorhersage der Auswirkungen genetischer und umweltbedingter Belastungen, wie sie beispielsweise durch Produktionsstress verursacht werden, ist für den Bereich des Metabolic-Engineering von wesentlicher Bedeutung. Somit kann der während dieser Arbeit erzeugte hochgenaue und umfassende Datensatz in prädiktiven mathematischen Modellen implementiert werden, wodurch ein Beitrag zum rationalen Design von Sekretionssystemen der nächsten Generation geleistet wird.

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Metadaten
Author: Minia Antelo VarelaORCiD
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-35148
Title Additional (German):Absolute und relative Quantifizierung von Membranproteinen - ein massenspektrometrischer Ansatz
Referee:Prof. Dr. Dörte Becher, Prof. Dr. Colin Robinson, Prof. Dr. Andreas Pich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2020/01/24
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/12/19
Release Date:2020/01/24
GND Keyword:Biotechnology, Mass spectrometry, Membrane proteins, Shotgun proteomics, Targeted proteomics
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie