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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002229-9

Herstellung rekombinanter Alkoholdehydrogenasen in der Hefe Arxula adeninivorans und ihre Verwendung für die Synthese enantiomerenreiner Alkohole

  • Die ADHs aus Rhodococcus ruber (RrADH) und Lactobacillus brevis (LbADH) wurden erstmals in der Hefe Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans) hergestellt und zur Synthese von enantiomerenreinen 1-Phenylethanol eingesetzt. Die entsprechenden Gene wurden hierfür mit dem starken konstitutiven TEF1-Promotor und dem PHO5-Terminator flankiert und unter Nutzung der etablierten Xplor2®-Transformations-/Expressionsplattform in der Hefe exprimiert. Die erhaltenen selektierten Transformanden wiesen dabei ADH-Aktivitäten von 21 bzw. 320 U g-1 dcw für die Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol in Schüttelkultur auf. RrADH und LbADH sind für die Reduktion von Acetophenon und Acetophenon-Derivaten, alpha-Ketoestern und aliphatischen Ketonen geeignet. Die RrADH synthetisiert (S)-konfigurierte Alkohole und ist NAD+/NADH-abhängig, während die LbADH die Reduktion von Acetophenon zu 1-(R)-Phenylethanol mithilfe des Cofaktors NADPH katalysiert. Rohextrakt des RrADH produzierenden Hefestamms konnte erfolgreich für die Synthese von enantiomerenreinem 1-(S)-Phenylethanol mit einer Ausbeute von 90 % und einem Enantiomerenüberschuss (ee) von >99 % über Substrat-gekoppelte Regeneration mit Isopropanol eingesetzt werden. Die Erhöhung der Ausbeute auf 100 % gelang durch Enzym-gekoppelte Regenerierung des Cofaktors NADH mit der GDH aus Bacillus megaterium (Bm) für RrADH bzw. NADPH mit der BmGDH und G6PDH aus Bacillus pumilus (Bp) für LbADH katalysierte Reaktionen. ADHs und Cofaktor-regenerierende Enzyme wurden simultan durch die konstitutive Coexpression der entsprechenden Gene in A. adeninivorans für die Synthese von enantiomerenreinem 1-Phenylethanol hergestellt. Die Enzymrohextrakte der RrADH-BmGDH, LbADH-BmGDH und LbADH-BpG6PDH produzierenden Hefestämme katalysieren ohne Ausnahme die Synthese des jeweiligen Enantiomers von 1-Phenylethanol mit ee >99 % und Ausbeuten von 100 % für Substratkonzentrationen bis 40 mM. Nach der Extraktion des 1-Phenylethanols liegt dieses chemisch rein vor, sodass aufwendige Aufarbeitungs- und Reinigungsschritte erspart bleiben. GDH bzw. G6PDH sind hervorragend für die Regeneration von NADH und NADPH bzw. ausschließlich letzterem geeignet. Dabei wurden standardmäßig 40 mol 1-Phenylethanol pro Mol NAD+ oder NADP+ erreicht. Auch intakte Hefezellen der rekombinanten ADH und BmGDH bzw. BpG6PDH synthetisierenden Stämme wurden für die Synthese von 1-(S)- bzw. 1-(R)-Phenylethanol verwendet. Nach Permeabilisierung mit Triton X-100 wiesen sie vergleichbare Aktivitäten zu den entsprechenden Rohextrakten auf. Der RrADH-BmGDH produzierende Stamm synthetisiert 1-(S)-Phenylethanol mit einer Aktivität von 20 U g-1 dcw, während die LbADH-BmGDH und LbADH-BpG6PDH Hefestämme sogar 45,6 und 87,9 U g-1 dcw lieferten. Die Ausbeuten und ee waren im Vergleich zu den Rohextrakten ähnlich. Die Erhöhung der Konzentration des Ausgangsstoffs Acetophenon reduzierte unabhängig von den verwendeten Enzymen die erhaltene Ausbeute. Die katalytische Produktivität der Biokatalysatoren wurde durch ihre Wiederverwendung erhöht. Hierfür wurden permeabilisierte Zellen, die einfach aus der Syntheselösung abzentrifugiert werden können, genutzt. Außerdem konnten der Rohextrakt und die Zellen nach ihrem Einschluss in unlösliches Calciumalginat in Form von kleinen Kügelchen aus der Synthese abfiltriert und wiederverwendet werden. Permeabilisierte Zellen und Immobilisate wurden wiederholt für die Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol eingesetzt, wobei immobilisierter Rohextrakt und Zellen für drei bis maximal sechs Synthesezyklen verwendet werden konnten. Immobilisierte und permeabilisierte Zellen sind wesentlich stabiler. Sie können ohne erhebliche Aktivitätsverluste 14 (LbADH-BpG6PDH), 29 (RrADH-BmGDH) bzw. mehr als 50 Mal (LbADH-BmGDH) wiederholt zur Acetophenon-Reduktion eingesetzt werden. Auf ihrer Grundlage wurde ein erster Reaktor für die semi-kontinuierliche Synthese von 1-(R)-Phenylethanol im Labormaßstab konstruiert und in Betrieb genommen. Es konnten 206 mol 1-(R)-Phenylethanol pro Mol NADP+ und 12,78 g 1-(R)-Phenylethanol mit einem ee von 100 % und einer Raum-Zeit-Ausbeute von 9,74 g L-1 d-1 oder 406 g kg-1 dcw d-1 erhalten werden. Weitere Optimierungen der Hefestämme, Reaktionsbedingungen und Reaktionsführung sind zur Erhöhung der Ausbeute und zum Erreichen vergleichbarer Produktivität mit derzeitigen Syntheseprozessen für 1-Phenylethanol nötig. Der ee ist bereits optimal. Zusammenfassend ist A. adeninivorans ein hervorragender Wirt zur Herstellung von ADHs für die Synthese enantiomerenreiner Alkohole wie 1-(S)- und 1-(R)-Phenylethanol. Nach Extraktion liegt das Produkt rein und mit optimalen ee vor. Durch die in dieser Arbeit gezeigten Untersuchungen können bisher chemische Synthesen durch enzymatische Reaktionen unter Einsatz von ADHs, deren Produktion in A. adeninivorans erfolgte, ersetzt werden, was Kosten und natürlichen Ressourcen spart.
  • The ADHs of Rhodococcus ruber (RrADH) and Lactobacillus brevis (LbADH) were produced in the yeast Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans) for the first time and were used for the synthesis of enantiomerically pure 1-phenylethanol. ADH genes were located between the strong constitutive TEF1 promotor and the PHO5 terminator and were expressed in the yeast by using the established Xplor2® transformation/expression platform. The transformants had activities between 21 and 320 U g-1 dcw for the reduction of acetophenone to 1-phenylethanol when grown in shake flasks. RrADH and LbADH are suitable for the reduction of acetophenone and acetophenone derivatives, alpha-ketoesters and aliphatic ketones. RrADH synthesizes (S)-configured alcohols and is NAD+/NADH dependent, whereas LbADH catalyzes the reduction of acetophenone to 1-(R)-phenylethanol with the cofactor NADPH. Crude extract of the RrADH-producing yeast strain was used successfully for the synthesis of enantiomerically pure 1-(S)-phenylethanol with a yield of 90 % and an enantiomeric excess (ee) of >99 % by substrate-coupled regeneration with isopropanol. An increase in yield to 100 % was possible by using enzyme-coupled regeneration of the cofactor NADH with GDH from B. megaterium (Bm) for RrADH or NADPH with BmGDH and G6PDH from B. pumilus (Bp) for LbADH catalyzed reactions. ADHs and cofactor regenerating enzymes were produced simultaneously in A. adeninivorans for the production of enantiomerically pure 1-phenylethanol by constitutive coexpression of the correspondent genes. Crude extracts of the RrADH-BmGDH, LbADH-BmGDH and LbADH-BpG6PDH producing strains synthesize the respective enantiomer of 1-phenylethanol with ee >99 % and yields of 100 % for substrate concentrations up to 40 mM. 1-Phenylethanol was chemically pure after extraction, so that laborious purification steps were not required. GDH is suitable for NADH and NADPH regeneration and G6PDH for NADPH recycling. Therefore 40 mol 1-phenylethanol per mol NAD+ or NADP+ were reached by default. In addition to crude extract, whole intact yeast cells of the recombinant ADH and BmGDH or BpG6PDH producing yeast strains were tested for the synthesis of enantiomerically pure 1-(S)- or 1-(R)-phenylethanol. Cells showed comparable activities to crude extracts after permeabilization with Triton X-100. The RrADH-BmGDH producing strain synthesized 1-(S)-phenylethanol with an activity of 20 U g-1 dcw, whereas LbADH-BmGDH and LbADH-BpG6PDH strains had activities of up to 45.6 and 87.9 U g-1 dcw. Yields and ee were only slightly lower compared to crude extract catalyzed reactions. The increase of the substrate concentration acetophenone reduced the yield which was independent from the enzymes that were used. Catalytic productivity of the biocatalysts was increased by its recycling. Enzyme recycling was realized either by reusing permeabilized cells which can be centrifuged from the reaction, or entrapment of crude extract and permeabilized cells in insoluble calcium alginate spheres, which allowed their removal from the reaction by filtration. Permeabilized cells and immobilisates were used repeatedly for the reduction of acetophenone to 1-phenylethanol. Immobilized crude extract and permeabilized cells could be reused for three to six synthesis cycles. Immobilized permeabilized cells could be used for acetophenone reduction without significant loss of activity 14 times for LbADH-BpG6PDH, 29 times for RrADH-BmGDH and more than 50 times for LbADH-BmGDH. The first reactor for the semi-continous synthesis of 1-(R)-phenylethanol in laboratory scale was constructed on their basis and was put into operation. 206 mol 1-(R)-phenylethanol per mol NADP+ and 12.78 g 1-(R)-phenylethanol with an ee of 100 % and a space-time yield of 9.74 g L-1 d-1 or 406 g kg-1 dcw d-1 were synthesized. Additional modification of the yeast strains, reaction conditions and operating conditions are necessary to increase the yield and result in productivity comparable to those of existing synthetic processes for 1-phenylethanol. The ee is already excellent. In summary A. adeninivorans is an excellent host for the production of ADHs for the synthesis of the enantiomerically pure alcohols, 1-(S)- or 1-(R)-phenylethanol. After extraction, the product is very pure without by-products with an optimal ee. This work shows that a biocatalytic synthesis using A. adeninivorans strains expressing ADHs can replace chemical synthesis. This would reduce the use of natural resources and be more cost efficient.

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Metadaten
Author: Marion Rauter
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002229-9
Title Additional (English):Production of recombinant alcohol dehydrogenases in the yeast Arxula adeninivorans and their application for the synthesis of enantiomerically pure alcohols
Advisor:Prof. Dr. Volkmar Passoth, Prof. Dr. Frieder Schauer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/05/26
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/04/29
Release Date:2015/05/26
Tag:1-Phenylethanol, enantiomerenrein
1-phenylethanol, enantiomerically pure
GND Keyword:1-(S)-Phenylethanol, Alkoholdehydrogenasen, Arxula adeninivorans, Hefe, Lactobacillus brevis, Rhodococcus ruber, Synthese
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie