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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002175-9

Functional and structural characterization of DacB and PccL, lipoproteins contributing to pneumococcal pathogenesis

  • Streptococcus pneumoniae (pneumococci) are lancet-shaped, Gram-positive, alpha-hemolytic, facultative anaerobic human specific commensals of the upper and lower respiratory tract. Pneumococci may convert to pathogenic bacteria and spread to the lungs and blood. In different population groups, such as children, the elderly and immunocompromised individuals, pneumococci can cause local infections such as bronchitis, rhinitis, acute sinusitis, and otitis media as well as life-threatening invasive diseases such as community-acquired pneumonia, sepsis and meningitis. Pneumococci are surrounded by a rigid and complex exoskeleton, the peptidoglycan, also referred to as murein sacculus. The peptidoglycan (PNG) protects the cells from rupture by osmotic pressure and maintains their characteristic shape. The PNG is a heteropolymer made up of glycan strands that are cross-linked by short peptides and during growth the existing murein is continuously hydrolyzed by specific lytic enzymes to enable the insertion of new peptidoglycan. Bacterial cell-wall hydrolases are essential for peptidoglycan turnover and crucial to preserve cell shape. The D,D-carboxypeptidase DacA and L,D-carboxypeptidase DacB of Streptococcus pneumoniae function in a sequential manner. This study determined the crystal structure of the surface-exposed lipoprotein DacB, which differs considerably from the DacA structure. DacB contains a Zn2+ ion in its catalytic center located in the middle of a fully exposed, large groove. Two different conformations with differently arranged active site topology were identified. In addition the critical residues for catalysis and substrate specificity were identified. Deficiency in DacA or DacB resulted in a modified peptidoglycan peptide composition and led to an altered cell shape of the dac-mutants. In contrast, lgt-mutant lacking lipoprotein diacylglyceryl transferase activity required for proper lipoprotein maturation retained L,D-carboxypeptidase activity and showed an intact murein sacculus. Furthermore, this study demonstrated the pathophysiological effects of disordered DacA or DacB activities. Real-time bioimaging of intranasally infected mice indicated a substantially attenuated virulence of dacB- and dacAdacB-mutants pneumococci, while loss of function of DacA had no significant effect. In addition, uptake of these mutants by professional phagocytes was enhanced, while their adherence to lung epithelial cells was decreased. The second part of this study focused on the functional and structure determination of the soluble dimeric pneumococcal lipoprotein PccL. Because of its calycin fold and structural homology with the lipocalin YxeF from Bacillus subtilis, PccL was introduced as the first member of the lipocalin protein family in pneumococci and named “PccL” (Pneumococcal calycin fold containing Lipoprotein). Similar to other lipocalins, the distinct beta-barrel, which is open at one end, is significantly conserved in PccL. Moreover, the application of the in vivo acute pneumonia mouse infection model and the in vitro phagocytosis as well as adherence invasion studies revealed considerable differences in colonization and invasive infection between the wild-type D39 and the pccL-mutant. In conclusion, this study characterized the crucial role of pneumococcal carboxypeptidases DacA and DacB for PGN architecture, bacterial shape and pathogenesis. By applying in vivo and in vitro approaches, a close relationship between PGN metabolism and pathophysiological effects was discovered. In addition, the high resolution structure of DacB has been solved and analyzed and a structure model with a resolution of 2.0 Å is provided. Furthermore, analysis of the PGN composition was applied to indicate the impact of an impaired lipoprotein biogenesis pathway on localization and activity of DacB. The major impact of carboxypeptidases on cell shape and virulence proposes DacB as a promising target for the development of novel drugs or due to its surface exposition also as a promising vaccine candidate. PccL is the first pneumococcal lipocalin-like protein and this study indicated its contribution to pneumococcal virulence. However, the mechanism and the mode of action of PccL are still unknown and have to be deciphered in further studies.
  • Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind Gram-positive, faktultativ anaerobe, humanspezifische Kommensalen des oberen und unteren Respirationstraktes. Pneumokokken können durch Ausbreitung in die Lunge und in das Blut vor allem in Risikogruppen wie Kleinstkindern, älteren Menschen und immunsupprimierten Patienten schwere sowie lebensbedrohliche Infektionen auslösen. Neben lokalen Infektionen wie einer Bronchitis, Rhinitis, akuten Sinusitis bzw. Otitis media (Mittelohrentzündung), können Pneumokokken ebenso lebensbedrohliche invasive Krankheiten wie zum Beispiel die ambulant erworbene Pneumonie, Sepsis und bakterielle Meningitis verursachen. Die Pneumokokken sind von einem rigiden, komplexen Exoskelett, dem Murein-Sacculus, besser als Peptidoglykan bekannt, umgeben. Während des Wachstums wird das existierende Peptidoglykan kontinuierlich durch spezifische lytische Enzyme hydrolysiert, um den Einbau von neuen Bausteinen in das Peptidoglykan zu ermöglichen. Bakterielle Zellwandhydrolasen sind essentiell für den Peptidoglykan-Umsatz und entscheidend für den Erhalt der Zellform. Die D,D-Carboxypeptidase DacA und die L,D-Caboxypeptidase DacB von Streptococcus pneumoniae wirken in sequentieller Weise. In dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur des oberflächenexponierten Lipoproteins DacB ermittelt, die starke Unterschiede zu der bereits bekannten Struktur von DacA aufweist. DacB enthält ein Zn2+-Ion in seinem katalytischen Zentrum, das sich in der Mitte einer frei zugänglichen Bindungstasche befindet. Zwei verschiedene Konformationen mit unterschiedlicher Topologie der aktiven Zentren wurden identifiziert. Zusätzlich wurden die für die Katalyse des Enzyms essentiellen Aminosäuren und die Substratspezifität ermittelt. Ein Mangel von DacA oder DacB resultierte in einer veränderten Peptidoglykan-Peptid-Zusammensetzung und führte zu einer veränderten Morphologie der Dac-defizienten Mutanten. Im Gegensatz dazu zeigte eine lgt-Mutante, der die Lipoprotein-Diacylglyceryl-Transferase-Aktivität fehlt, welche für erfolgreiche Lipoproteinreifung erforderlich ist, eine L,D-Carboxypeptidase-Aktivität. Die Bakterienzelle wies daher auch einen intakten Murein-Sacculus auf. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit die pathophysiologischen Effekte einer veränderten DacA-bzw. DacB-Aktivität gezeigt. Das in Echtzeit durchgeführte in vivo Bioimaging von intranasal infizierten Mäusen zeigte eine erhebliche Abschwächung der Virulenz in dacB- und dacAdacB-mutierten Pneumokokken, während der alleinige Funktionsverlust von DacA keinen signifikanten Effekt auf die Virulenz der Pneumokokken hatte. Zudem war die Aufnahme dieser Mutanten durch professionelle Phagozyten verstärkt, während die Adhärenz dieser Mutanten an Lungenepithelzellen vermindert war. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit der funktionellen und strukturellen Charakterisierung des löslichen dimeren Pneumokokken-Lipoproteins PccL. Aufgrund der Calycin-Faltung und der Strukturhomologie mit dem Lipocalin YxeF von Bacillus subtilis wurde PccL als erstes Mitglied der Lipocalin-Proteinfamilie in Pneumokokken identifiziert und das Protein als “PccL” (Pneumococcal calycin fold containing Lipoprotein) benannt. Ein charakteristisches Strukturmotiv der Lipocalin-Proteinfamilie ist die ausgeprägte fassförmige Struktur aus beta-Faltbättern, welche an einem Ende offen ist. Dieses Strukturmotiv liegt signifikant konserviert in PccL vor. Darüber hinaus zeigten die Infektionsversuche unter Ausnutzung des in vivo akuten Pneumoniemausmodells und der in vitro Phagozytose eine signifikante Attenuation der Virulenz. Die Adhärenz- und Invasionssstudien mit Lungenepithelzellen zeigten eine verringerte Effizienz der Kolonisierung und invasion für die pccL-Mutante im Vergleich zum isogenen Wildtyp D39. Diese Studie charakterisiert damit die maßgebliche Rolle der Carboxypeptidasen DacA und DacB für den Peptidoglykanaufbau in Pneumokokken, die Form der Bakterien und die Pathogenese. Unter Verwendung von in vivo- und in vitro-Ansätzen wurde eine enge Beziehung zwischen Peptidoglykan-metabolismus und pathophysiologischen Effekten aufgedeckt. Des Weiteren wurde die Struktur von DacB mit einer Auflösung von 2,0 Å aufgeklärt, auf charakteristische Strukturmerkmale hin analysiert, und ein Strukturmodell erstellt. Außerdem wurde die Peptidoglykanzusammensetzung analysiert, um den Einfluss einer beeinträchtigten Lipoproteinbiogenese auf die Lokalisation und Aktivität von DacB aufzuzeigen. Aufgrund des großen Einflusses von Carboxypeptidasen auf Zellform und Virulenz ist DacB ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung neuer Arzneimittel bzw. aufgrund seiner Oberflächenexposition ein verheißungsvoller Kandidat für die Impfstoffentwicklung. PccL ist das erste bei Pneumokokken identifizierte Lipocalin und es konnte in dieser Arbeit auch gezeigt werden, das bakterielle Proteine der Lipocalinfamilie an der bakteriellen Virulenz beteiligt sein können.

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Metadaten
Author: Mohammed Redha Abdullah
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002175-9
Title Additional (German):Funktionelle und strukturelle Charakterisierung von DacB und PccL-Lipoproteine, die zur Pneumokokken-Pathogenese beitragen
Advisor:Prof. Dr. Sven Hammerschmidt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2015/03/06
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/02/27
Release Date:2015/03/06
Tag:akutes Pneumonie-Modell, bakterielle Lipocalin
acute pneumonia model, bacterial lipocalin
GND Keyword:Carboxypeptidase, Lipoproteine, Pneumokokken
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie