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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000994-1

Molekulare Mechanismen der Adaptation sowie Impfstudien zur Bekämpfung von aviären Influenza-A-Viren

  • Wildvögel stellen die natürlichen Wirte und das Hauptreservoir für Influenza-A-Viren dar. Einige Influenza-Stämme konnten sich zudem an verschiedene Säugetierarten wie Mensch, Schwein oder Pferd anpassen. Die molekularen Mechanismen der Adaptation von Influenza-A-Viren an einen neuen Wirt sind komplex. Sie werden u. a. auf eine modifizierte Interaktion viraler Proteine mit Wirtszellproteinen zurückgeführt, die in Verbindung mit dem Auftreten von Punktmutationen in viralen Proteinen, vor allem den Polymeraseproteinen, steht und zu einer optimierten Replikation von Influenza-A-Viren im neuen Wirt führen kann. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden molekulare Werkzeuge entwickelt, die der Identifizierung wirtsspezifischer Interaktionspartner der viralen Ribonukleoprotein-Komplexe (vRNP) dienen können. Dazu wurden mittels reverser Genetik rekombinante Influenza-A-Viren unterschiedlichen Wirtsspektrums mit einem Strep-tag als Markierung am C-Terminus der Polymerase-Untereinheit PB2 generiert. Zu den verwendeten Viren zählten das humane A/HongKong/1/68 (H3N2), die beiden speziesübergreifenden Viren A/swan/Germany/R65/06 (H5N1) (‚R65‘) sowie A/seal/Massachusetts/1/80 (H7N7) und das aviäre A/duck/Ukraine/1/63 (H3N8). Durch Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Analysen wurde die stabile Expression des Strep-PB2-Fusionsproteins in infizierten Zellen bestätigt. Es wurde zudem gezeigt, dass die markierten Viren auf Säuger- und Vogelzellen vergleichbar mit den entsprechenden unmarkierten Viren replizieren. Anhand des Strep-getaggten PB2-Proteins des R65-Virus wurden erfolgreich virale RNP-Komple xe aus infizierten Säuger- und Vogel-Zellen mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt und deren vier Protein-Bestandteile PB2, PB1, PA und NP durch MALDI-tof-Massenspektrometrie identifiziert. Die Palette getaggter Viren bildet die Grundlage für weiterführende Studien zur Untersuchung Virus-Wirt-spezifischer Wechselwirkungen, die für den Wirtswechsel und die Adaptation von Influenza-A-Viren entscheidend sein können. Die Entstehung des pandemischen Influenza-Virus A/HongKong/1/68 (H3N2) (‚Hk68‘) geht auf ein Reassortment zwischen dem zuvor zirkulierenden humanen H2N2-Virus und einem aviären H3-Stamm zurück. Hierbei wurden die Segmente des humanen Virus, die für das Rezeptor-bindende Protein Haemagglutinin (HA) und die Polymerase-Untereinheit PB1 kodieren, gegen die entsprechenden Segmente des aviären H3-Virus ausgetauscht. Bei einem Sequenzvergleich zwischen dem Hk68-PB1 und dem PB1 des dem unbekannten aviären Donor nahestehenden Isolates A/duck/Ukraine/1/63 (H3N8) (‚dUk‘) wurden lediglich sechs Unterschiede in der Aminosäuresequenz identifiziert, die möglicherweise Folge der Adaptation des Hk68-Virus an den humanen Wirt sind. Nach dem Einfügen der einzelnen Mutationen in das dUk-PB1 wurden homologe RNP-Komplexe (PB2, PB1 und PA sowie NP von Hk68) und heterologe RNP-Komplexe (PB2, PA, NP von Hk68 und PB1 bzw. PB1-Punktmutante von dUk) in transfizierten Säugerzellen rekonstituiert. Mit Hil fe eines Luciferase-Reportertests konnte gezeigt werden, dass der heterologe Hk68/dUk-PB1-Komplex im Vergleich zum homologen Hk68-Komplex eine um 50% erniedrigte Polymerase-Aktivität aufweist. Dieser negative Effekt konnte durch das Einfügen der Mutation PB1 I12V in das dUk-PB1, aber nicht durch eine der anderen fünf Punktmutationen, vollständig aufgehoben werden. Folglich könnte es sich bei dieser Mutation um eine adaptive Mutation handeln. Untersuchungen an in vitro rekonstituierten RNP-Komplexen anderer Viren konnten diese Theorie unterstützen. Wachstumskinetiken des homologen Hk68- und dUk-Virus sowie von ihnen abgeleiteter PB1-Reassortanten und PB1-Mutanten deuteten ebenfalls auf einen Einfluss von Aminosäureposition 12 im PB1-Protein auf die Virusreplikation hin. Mit Hilfe eines ELISAs durchgeführte Bindungsstudien zwischen den PA-Proteinen verschiedener Influenza-A-Viren und PB1-Peptiden mit Valin oder Isoleucin an Position 12 legten zudem eine Zu- bzw. Abnahme der Af finität zwischen PA und PB1 als Ursache für die veränderte Polymeraseaktivität nahe. Hochpathogene aviäre Influenza-A-Viren (HPAIV) vom Subtyp H5 oder H7 verursachen enorme wirtschaftliche Schäden und stellen eine potentielle Bedrohung für den Menschen dar. Die Entwicklung effektiver Impfstoffe ist deshalb in vielfacher Hinsicht sinnvoll. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels reverser Genetik eine Elastase-abhängige Mutante des HPAIV A/swan/Germany/R65/06 (H5N1), genannt R65-E, als potentielle lebend-attenuierte Vakzine erzeugt. Dazu wurde die polybasische Spaltstelle im HA des hochpathogenen Virus gegen eine Spaltstelle für die in vivo kaum verfügbare Protease Elastase ersetzt. In vitro wurde mit Hilfe von Plaquetests, Wachstumskinetiken und Western-Blot-Analysen die strikte Abhängigkeit der R65-E-Replikation und der R65-E-HA-Spaltung von Elastase nachgewiesen. Im Gegensatz zum R65-Wildtyp war die R65-E-Mutante in vivo aufgrund der Abwesenheit von Elastase auf einen Replikationszyklus beschränkt und somit hochgradig attenuiert. Insgesamt erwies sich die R65-E-Mutante im Huhn jedoch als wenig immunogen. So kam es 7 Tage nach okulonasaler Infektion von Eintagsküken lediglich zu einer schwachen zellulären Immunantwort basierend auf CD8+ zytotoxischen T-Zellen in der Milz. Eine Antikörper-Antwort wurde nach o kulonasaler oder in ovo Infektion nur bei jeweils einem von zehn bzw. einem von sieben Tieren induziert. Das Vorhandensein H5-spezifischer Antikörper korrelierte hierbei mit einem Schutz der Tiere gegen eine Belastungsinfektion mit dem homologen HPAIV R65. Gleichermaßen ging die Abwesenheit H5-spezifischer Antikörper bei den übrigen Versuchstieren mit einem letalen Verlauf der homologen R65-Belastungsinfektion einher. Ein partieller Schutz gegen eine heterosubtypische Belastungsinfektion mit dem HPAIV R65-H9R66mutR65 sowie eine reduzierte Virusausscheidung bei einigen Tieren der Boostergruppe, die drei Wochen nach okulonasaler Infektion eine zweite Dosis R65-E erhalten hatten, deuteten auf eine R65-E-induzierte zellvermittelte Schutzwirkung hin. Es ist zu vermuten, dass die R65-E-Mutante in vivo überattenuiert war und aus diesem Grund keine protektive Immunabwehr induzieren konnte. R65-E eignet sich daher nicht als lebend-attenuierte Geflügelvakzine.
  • Wild birds are the natural hosts and main reservoir for influenza A viruses of all known subtypes. However, some influenza viruses have established stable lineages in mammals. The molecular basis of host restriction and adaptation of influenza viruses is determined by the interaction of viral proteins with specific host cell factors and based on adaptive point mutations in the viral polymerase proteins enhancing viral replication in a species-specific manner. To identify host-specific interaction partners of viral ribonucleoprotein (vRNP) complexes, recombinant influenza A viruses with a Strep affinity tag at the C-terminus of the polymerase protein PB2 were generated by reverse genetics. For this, a human H3N2 strain, an avian H3N8 strain and two strains of subtype H5N1 and H7N7 infecting avian and mammalian hosts were used. The stable expression of Strep-tagged fusion protein in infected cells was confirmed by immunofluorescence and Western blot analysis. Replication of tagged mutants was shown to be comparable to that of the untagged recombinant parent viruses. Tagged vRNP complexes were purified from human and avian cell extracts by affinity chromatography. All vRNP protein components were successfully identified by MALDI-tof mass spectrometry. These experiments form the basis for ongoing studies to investigate virus-host-specific interactions that are important for host switch and adaptation of influenza A viruses. The pandemic virus A/Hong Kong/1/68 (H3N2) (Hk68) is a reassortant between the at that time circulating human H2N2 and an avian H3 strain which provided its HA and PB1 segments. The avian donor virus is supposed to have a common ancestor with reference strain A/duck/Ukraine/1/63 (H3N8) (dUk). The alignment of the PB1 segments revealed six amino acid substitutions suggesting relevance for adaptation of Hk68-PB1. To investigate their adaptive potential, these point mutations were introduced into dUk-PB1. Homologous (PB2, PB1, PA, NP from Hk68) and heterologous (PB2, PA, NP from Hk68 and PB1 or PB1 mutant from dUk) RNP complexes were reconstituted in vitro in transfected human cells and polymerase activity was determined by a luciferase reporter assay. dUk-PB1 reduced the polymerase activity of the heterologous Hk68 complex by 50%. This negative effect was abolished by insertion of PB1 I12V into dUk-PB1 but not by any of the other 5 point mutations. Therefore, PB1 I12V could be an adaptive mutation. This hypothesis was supported by comparing the polymerase activity of other influenza A viruses with either valin or isoleucin at PB1 position 12. Growth kinetics of homologous Hk68 and dUk virus, their reassortants and PB1 mutants also implied an influence of PB1 amino acid position 12 on viral replication. Binding studies of different PA proteins to PB1 peptides with either valin or isoleucin at position 12 also suggested an altered affinity between both proteins as a reason for the differing polymerase activity. Highly pathogenic avian influenza A viruses (HPAIV) of subtype H5 and H7 are a major economic burden and a threat to human health. The development of efficient vaccines against HPAIV is therefore highly desirable. In the present study, an elastase-dependent mutant of HPAIV A/swan/Germany/R65/06 (H5N1) was generated by reverse genetics (R65-E). The polybasic cleavage site of parental R65 was replaced by a cleavage site for elastase. The strict dependence of R65-E replication on the availability of elastase was confirmed in vitro by plaque assays, growth kinetics and western blot analysis. In contrast to HPAIV R65 and due to the absence of elastase, R65-E was highly attenuated in vivo. Unexpectedly, R65-E was not immunogenic in chicken. After oculonasally infecting 1-day-old chicks with R65-E only a slight cell-mediated immune response based on CD8+ cytotoxic T-lymphocytes was detected. Additionally, antibody was induced in only one of ten or seven chickens each after oculonasal or in ovo R65-E infection. Here, the presence of H5-specific antibodies correlated with protection against homologous HPAIV challenge. Partial protection against heterosubtypic challenge with HPAIV R65-H9R66mutR6 5 and reduced viral shedding in some animals immunized twice with R65-E was probably linked to a cell-mediated immune response. R65-E is very likely to be over-attenuated in vivo and thus did not induce a protective immune response. It is not a suitable live attenuated vaccine against HPAIV in chicken.

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Metadaten
Author: Jana Hundt
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000994-1
Title Additional (English):Molecular mechanisms of adaptation and vaccine studies to control avian influenza A viruses
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/05/31
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/05/25
Release Date:2011/05/31
GND Keyword:Elastase-abhängige Lebend-attenuierte Vakzine, Influenza-A-Virus, Virulenz, Wirtsfaktoren
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie