Open Access

Alexander Graf

• Microbial biofilms can be defined as multicellular clusters of microorganisms embedded in a self-produced extracellular matrix (ECM), which is primarily composed of polymeric biomolecules. Biofilms represent one of the most severe burdens in both industry and healthcare worldwide, causing billions of dollars of treatment costs annually because biofilms are inherently difficult to prevent, treat, and eradicate. In health care settings, patients suffering from cystic fibrosis, or patients with medical implants are highly susceptible to biofilm infections. Once a biofilm is formed, it is almost impossible to quantitatively eradicate it by mechanical, enzymatical, chemical, or antimicrobial treatment. Often the only remaining option to fully eradicate the biofilm is removing of the infected implant or body part. The primary reasons for the inherent resistance of biofilms against all forms of antimicrobial treatment are (I) a reduced metabolic activity of biofilm-embedded cells climaxing in the presence of metabolic inactive persister cells, as well as (II) the protective nature of the biofilm matrix acting as a (diffusion) barrier against antimicrobials and the host immune system. Consequently, there is an urgent need to better understand microbial biofilms from a structural and (patho-) physiological point of view in order to be able to develop new treatment strategies. Therefore, the aims of this study were to investigate fundamental physiological properties of different clinically relevant single and multi-species biofilms, both in vitro and in vivo. Furthermore, the effectiveness of a novel treatment strategy using cold atmospheric pressure plasma was evaluated in vitro to treat biofilms of the pathogenic fungus C. albicans. In article I, the intracellular and ECM protein inventory of Staphylococcus aureus during in vitro biofilm growth in a flow reactor was analyzed by liquid-chromatography coupled to tandem mass-spectrometry (LC-MS/MS) analysis combined with metabolic footprint analysis. This analysis showed that anaerobiosis within biofilms releases organic acids lowering the ECM pH. This, in turn, leads to protonation of alkaline proteins – mostly ribosomal proteins originating from cell lysis as well as actively secreted virulence factors – resulting in a positive net charge of these proteins. As a consequence, these proteins accumulate within the ECM and form an electrostatic network with negatively charged cell surfaces, eDNA, and metabolites contributing to the overall biofilm stability. In article II, the in vivo metaproteome of the multi-species biofilm community in cystic fibrosis sputum was investigated. To this end, an innovative protocol was developed allowing the enrichment of microbial cells, the extraction of proteins from a small amount of cystic fibrosis sputum, and subsequent metaproteome analysis. This protocol also allows 16S sequencing, metabolic footprint analysis, and microscopy of the same sample to complement the metaproteome data. Applying this protocol, we were able to significantly enhance microbial protein coverage providing first insights into important physiological pathways during CF lung infection. A key finding was that the arginine deaminase pathway as well as microbial proteases play a so far underappreciated role in CF pathophysiology. In articles III and IV, a novel treatment strategy for biofilms formed by the important fungal pathogen Candida albicans was evaluated in vitro. Biofilms were treated with two different sources of nonthermal plasma (with the Nonthermal Plasma Jet “kINPen09” as well as with the Microwave-induced plasma torch “MiniMIP”) and the effect on growth, survival, and viability was assessed by counting colony-forming units (CFU), by cell proliferation assays, as well as by live/dead staining combined with fluorescence microscopy, confocal laser scanning microscopy, (CLSM) and atomic force microscopy (AFM). These tests revealed that biofilms were effectively inactivated mostly on the bottom side of biofilms, indicating a great potential of these two plasma sources to fight biofilms.
• Mikrobielle Biofilme sind ubiquitär verbreitete, multizelluläre Aggregate, welche in eine selbst- produzierte, extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet sind. Diese extrazelluläre Matrix besteht hauptsächlich aus polymeren Substanzen wie beispielsweise Proteinen und extrazellulärer DNA. Im infektionsbiologischen Kontext sind insbesondere Patienten, die ein medizinisches Implantat erhalten haben oder an Mukoviszidose leiden, anfällig für Biofilm-Infektionen. Sobald sich ein Biofilm etabliert hat, ist eine quantitative Entfernung der biofilm-assoziierten Zellen durch mechanische, chemische, enzymatische oder antibiotische Behandlung nahezu unmöglich, wodurch oftmals eine Entfernung des betroffenen Implantats oder Körperteils die letzte Behandlungsoption darstellt. Dies kann durch eine reduzierte metabolische Aktivität der Zellen (bis hin zur metabolischen Inaktivität von sog. Persister-Zellen) sowie durch den Schutz der extrazellulären Matrix, die als effektive (Diffusions-) Barriere gegen Antibiotika und das Immunsystem wirkt, bedingt sein. Diese Schlüsseleigenschaften verleihen Biofilm-assoziierten Zellen eine massiv erhöhte Toleranz gegenüber Antibiotika, machen Biofilme zu einer der größten Infektions-assoziierten Belastungen und Gefahren im Gesundheitswesen und verursachen weltweit jährliche Behandlungskosten in Milliardenhöhe. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, die Struktur und Funktion mikrobieller Biofilme besser zu verstehen, um so innovative Behandlungsstrategien entwickeln zu können. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, grundlegende strukturelle sowie patho-physiologische Eigenschaften wichtiger bakterieller und fungaler Biofilm-Bildner in vitro und in vivo zu untersuchen, sowie die Wirksamkeit einer neue Behandlungsstrategie durch Niedertemperaturplasmen in vitro zu evaluieren. In Publikation I wurde das intrazelluläre sowie das Proteom der extrazellulären Matrix von einem der wichtigsten Biofilm-Bildner – Staphylococcus aureus – mittels Flüssigkeits- chromatographie-gekoppelter Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert. Hierfür wurden die Biofilme in vitro in einem Durchflussreaktor kultiviert. Struktur und Zusammensetzung des Biofilms wurden mit Hilfe globaler Proteom- und Metabolomanalysen sowie mikroskopischen Untersuchungen charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass der anaerobe Metabolismus der Biofilm-assoziierten Zellen durch die Sekretion organischer Säuren zu einer Absenkung des pH-Werts der ECM führt. Diese Ansäuerung wiederum führt zur Protonierung alkalischer ECM Proteine, darunter vornehmlich ribosomale Proteine, die durch Zelllyse freigesetzt werden sowie aktiv sekretierte Virulenzfaktoren. Diese positiv geladenen, alkalischen Proteine akkumulieren in der Folge in der ECM und bilden ein elektrostatisches Netzwerk mit negativ-geladenen Zelloberflächen, eDNA und Metaboliten, was gesamtheitlich zur Biofilmstabilität beiträgt. In Publikation II wurde die Zusammensetzung und der physiologische Zustand mikrobieller Biofilme aus Sputum-Proben von Mukoviszidose-Patienten mittels Metaproteom-Analysen untersucht. Diese Multispezies-Biofilme spielen eine entscheidende Rolle für das Fortschreiten der Krankheit, konnten bisher jedoch auf Proteomebene aufgrund ihrer Komplexizität nur schwer analysiert werden. Daher wurde erstmals ein Aufarbeitungsprotokoll etabliert, das es erlaubt, Mikroorganismen aus Sputum-Proben mit geringem Volumen anzureichern, Proteine zu extrahieren und mittels Metaproteom-Analysen zu charakterisieren. Zusätzlich konnten aus derselben Sputum-Probe 16S Sequenzierungen, Messungen der extrazelluläre Metabolite sowie mikroskopische Analysen durchgeführt werden. Durch die Anwendung dieses Protokolls war es möglich, die Anzahl identifizierter Proteine signifikant zu erhöhen, sodass erste Einblicke in die Pathophysiologie von Schlüsselkeimen der CF-Lunge auf Proteom-Ebene gewonnen werden konnten. Diese ersten Metaproteom-Daten zeigen, dass der Arginin-Deaminase-Stoffwechselweg sowie mikrobielle Proteasen eine bisher unterschätzte Rolle im Infektionsgeschehen spielen könnten. In Publikation III und IV wurde eine innovative Strategie zur Bekämpfung von Biofilmen des pathogenen Pilzes Candida albicans mittels Niedertemperatur-Plasmen evaluiert. Hierfür wurden C. albicans Biofilme mit zwei verschiedenen Plasmaquellen (mit dem sog. Nonthermal Plasma Jet “kINPen09” sowie der sog. Microwave-induced plasma torch “MiniMIP”) behandelt. Der Effekt auf das Wachstum, Überleben und die Vitalität wurden mittels Bestimmung der Kolonie-bildenden Einheiten (engl. CFU), Zellproliferations-Assays, sowie Lebend-Tot- Färbung kombiniert mit Fluoreszenz- und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (engl. CLSM) bestimmt. Strukturelle Auswirkungen auf behandelte C. albicans Biofilme wurden zudem mittels Rasterkraftmikroskopie (engl. AFM) untersucht. Diese Experimente zeigten, dass die Behandlung mit beiden Plasma-Quellen jeweils einen starken Inaktivierungs-Effekt auf C. albicans Biofilme hat – vornehmlich auf der Unterseite der Biofilme – was das große Potential dieser beiden Plasma-Quellen im Kampf gegen mikrobielle Biofilme aufzeigt.