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Anna Marta Hajdukowicz

• Despite the extensive ongoing research, there still exist plenty of diseases whose mechanisms have not yet been fully understood, one such example being proteasome-related disorders. Over the last few years, an increasing number of studies have been initiated to elucidate their driving pathophysiological mechanisms. Determining the systematic effects of genomic alterations occurring in genes encoding 19S proteasome subunits is a key to comprehend the molecular basis of syndromic intellectual disability (ID) pathogenesis and the subsequent design of new targeted therapies. Therefore, the main objective of my research was to contribute to the identification of potential drivers of syndromic ID, and thereby pave the way for the development of new targeted therapy approaches. In this regard, my aim was to characterize tissue, proteomic and metabolomic changes in cells from patients with PSMC5 mutations and uncover a potential dysregulation of various biochemical and/or inflammatory pathways. To this end, I undertook a comparative examination of control and patient T cells expanded from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). First, I assessed the proteasome composition in these samples (both in its denaturized and native form), by means of SDS-PAGE, native PAGE and western-blotting. Moreover, I determined proteasome chymotrypsin-like activity by measure of Suc-LLVY-AMC peptidase activity assay. In addition, I analysed the activation status of the ER stress and mTOR pathway by RT-PCR and SDS-PAGE /western-blotting prior to a subsequent analysis of T-cell markers. The data show that the investigated p.(Pro320Arg) and p.(Arg201Trp) de novo heterozygous missense mutations in the PSMC5 gene do not cause haploinsufficiency as the steady-state expression level of the PSMC5/Rpt6 full-length protein does not vary between control and patient cells. Further analysis of control and patient T cells under non-reducing conditions revealed that PSMC5/Rpt6 mutants were less efficiently incorporated into 26S proteasome complexes than their wild-type counterparts. The failure to assemble PSMC5/Rpt6 into fully mature proteasomes was associated with a reduced proteasome chymotrypsin-like activity in patient T cells, as determined by in-plate assays. These data unambiguously demonstrate that both of the p.(Pro320Arg) and p.(Arg201Trp) PSMC5 mutations identified in patients suffering from syndromic ID are loss-of-function mutations. Interestingly, my data further show that proteasome dysfunction in these patients was accompanied by abnormalities in mTOR signalling and T-cell differentiation, as determined by western-blotting and flow cytometry, respectively. Altogether, our data identified for the first time PSMC5 as a disease-causing gene for a syndromic form of ID. How proteasome dysfunction caused by PSMC5 variants contributes to disease pathogenesis, remains to be fully determined.
• Trotz umfangreicher Forschungsarbeiten gibt es immer noch zahlreiche Krankheiten, deren Mechanismen noch nicht vollständig geklärt sind, dazu gehörend proteasomassoziierte Dysfunktionen. In den letzten Jahren wurde zunehmend Studien eingeleitet, um die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu erforschen. Die Bestimmung der systematischen Auswirkungen genomischer Veränderungen in Genen, die für 19S-Proteasom-Untereinheiten kodieren, ist ein Schlüssel zum Verständnis der molekularen Grundlagen der Pathogenese von syndromaler geistiger Behinderung und zur anschließenden Entwicklung zielgerichteter Therapien. Das Hauptziel meiner Forschung bestand daher darin, einen Beitrag zur Identifizierung potenzieller Auslöser der syndromalen geistigen Behinderung zu leisten und damit den Weg für die Entwicklung neuer gezielter Therapieansätze zu ebnen. In diesem Zusammenhang war es mein Ziel, Gewebe-, Proteom- und Metabolomveränderungen in Zellen von Patienten mit PSMC5-Mutationen zu charakterisieren und eine mögliche Dysregulation verschiedener biochemischer und/oder entzündlicher Signalwege aufzudecken. Zu diesem Zweck habe ich eine vergleichende Untersuchung von Kontroll- und Patienten-T-Zellen durchgeführt, die aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (eng. PBMCs) expandiert wurden. Zunächst bewertete ich die Proteasom-Zusammensetzung in diesen Proben (sowohl in denaturierter als auch in nativer Form) mit Hilfe von SDS-PAGE, native PAGE und Western-Blotting. Darüber hinaus habe ich die chymotrypsinähnliche Aktivität des Proteasoms mit Hilfe des Suc-LLVY-AMC-Peptidase-Assay bestimmt. Außerdem analysierte ich den Aktivierungsstatus des ER-Stress- und mTOR-Signalwegs mittels RT-PCR und SDS-PAGE/Western-Blotting vor einer anschließenden Analyse von T-Zell-Markern. Die Daten zeigen, dass die untersuchten p.(Pro320Arg) und p.(Arg201Trp) neuartige heterozygoten Misende-Mutationen im PSMC5-Gen keine Haploinsuffizienz verursachen, da sich das Steady-State-Expressionsniveau des PSMC5/Rpt6-Volllängenproteins zwischen Kontroll- und Patientenzellen nicht unterscheidet. Weitere Analysen von Kontroll- und Patienten-T-Zellen unter nicht-reduzierenden Bedingungen ergaben, dass PSMC5/Rpt6-Mutanten weniger effizient in 26S-Proteasom-Komplexe eingebaut wurden als ihre Wildtyp-Pendants. Die Tatsache, dass PSMC5/Rpt6 nicht in das voll ausgereifte Proteasom eingebaut werden konnte, ging mit einer verminderten verminderten chymotrypsinähnlichen Aktivität des Proteasoms in den T-Zellen der Patienten einher, wie durch In-Plate-Assays festgestellt wurde. Diese Daten zeigen eindeutig, dass es sich bei den beiden PSMC5-Mutationen p.(Pro320Arg) und p.(Arg201Trp), die bei Patienten mit syndromaler geistigen Behinderung identifiziert wurden, um Funktionsverlustmutationen handelt. Interessanterweise zeigen meine Daten überdies, dass die Proteasom-Dysfunktion bei diesen Patienten mit Anomalien bei der mTOR-Signalisierung und der T-Zell-Differenzierung einhergeht, wie durch Western-Blotting bzw. Durchflusszytometrie festgestellt wurde. Insgesamt haben unsere Daten zum ersten Mal PSMC5 als krankheitsverursachendes Gen für eine syndromale Form der geistigen Behinderung identifiziert. Wie die durch PSMC5-Varianten verursachte Proteasom-Dysfunktion zur Pathogenese der Krankheit beiträgt, muss in der Zukunft noch vollständig geklärt werden.