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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001783-6

Apoptose und Autophagozytose in Krebszellen: Mechanismen des Zelltodes, verursacht durch Sigma-Rezeptor-Liganden und photoaktivierbare Pt(IV)-Komplexe

  • In der vorliegenden Arbeit sollten zwei verschiedene Wirkstoffklassen auf ihre Fähigkeit Apoptose und Autophagozytose zu aktivieren analysiert werden. Dabei wurden 39 Sigma-Rezeptor-Liganden, die an der Universität Münster (Arbeitsgruppe von Prof. Bernhard Wünsch) synthetisiert wurden, zunächst auf ihre antiproliferativen Eigenschaften in acht humanen Krebszelllinien untersucht. Anhand der Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnte gezeigt werden, dass sich große, raumfüllende Substituenten an beiden N-Atomen des Piperazin-Grundgerüstes positiv auf die Hemmung des Zellwachstums auswirken. Da die Multiple Myelom Zellinie RPMI 8226 eine hohe Dichte an Sigma-Rezeptoren exprimiert, wurde sie für weitere Versuche herangezogen. Als repräsentative Liganden wurde das Enantiomerenpaar (S)-11 und (R)-11 für weitere Versuche ausgewählt, da es neben einer guten Affinität zu beiden Rezeptor-Subtypen auch antiproliferierende Eigenschaften in der RPMI 8226-Zelllinie zeigte. Die Behandlung führte zur zeitabhängigen Induktion der Apoptose, die mit den typischen Charakteristika wie morphologische Membranausstülpungen, Annexin-V positive Zellen und der Chromatinkondensation einherging. Die Detektion von aktivierter Caspase-3, -8 und -9 im Durchflusszytometer deutete zunächst auf eine Beteiligung beider Signalwege der Apoptose hin. Da im Western Blot keine Caspase-9-Spaltprodukte detektiert werden konnten und auch die Vorinkubation mit den Caspase-Inhibitoren z-VAD-FMK und M50054 keinen Effekt auf die Apoptoserate bewirkte, scheinen die Caspasen im Sigma-Ligand-vermittelten Zelltod eine untergeordnete Rolle einzunehmen. Die frühe Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials verbunden mit der zunehmenden Konzentration des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) im Zytosol der RPMI 8226-Zellen deuten ebenfalls auf eine Caspase-unabhängige Form der Apoptose hin, die besonders für Sigma(2)-Agonisten bereits beschrieben ist. Und auch in diesem Projekt zeigen die Sigma-Liganden zytotoxische Aktivitäten, wenn sie eine Affinität zum Sigma(2)-Rezeptor aufweisen. Neben der Apoptose konnten (S)-11 und (R)-11 auch die Autophagozytose induzieren. Dieser Prozess scheint jedoch der Apoptose nachgeschaltet zu sein und weist darauf hin, dass es sich nicht um einen Schutzmechanismus der Zelle handelt, sondern eher in einer direkten Form des programmierten Zelltodes vom Typ II begründet ist. Dieser ist bisher noch nicht für Sigma-Rezeptor-Liganden beschrieben und könnte einen Vorteil gegenüber anderen Vertretern dieser Wirkstoffklasse darstellen. Eine Gemeinsamkeit von Sigma-Ligand-induzierter Apoptose und Autophagozytose liegt in ihrer Aktivierung durch die Lipidperoxidation. Es wurde ein sehr früher Anstieg von LPO-Produkten detektiert, der sich nur durch das lipophile Antioxidans alpha-Tocopherol beeinflussen ließ. Desweiteren konnte die antiproliferierende Wirkung von (S)- 11 und (R)-11 im MTT-Assay komplett blockiert werden, und auch die Apoptoseraten wurden durch den Radikalfänger signifikant erniedrigt. Die Hemmung der LC3-II-Expression im Western Blot durch alpha-Tocopherol verdeutlicht auch hier die Beteiligung der LPO an der Autophagozytose. Als Vertreter einer weiteren Wirkstoffklasse wurde der phtoaktivierbare Pt(IV)-Komplex FM 165, der in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Peter Sadler (Universität Warwick, UK) synthetisiert wurde, untersucht. Die antiproliferierenden Eigenschaften der photoaktivierbaren Pt(IV)-Verbindung können nicht mit der Apoptose als Zelltodmechanismus begründet werden. In diesem Fall ließen sich keine morphologischen Charakteristika nachweisen und auch die Annexin-V Anfärbung fiel negativ aus. Die weiteren Untersuchungen zeigten jedoch auch die Aktivierung der Autophagozytose durch Expression von LC3-II und p62 im Western Blot. Eine Hemmung lysosomaler Enzyme durch die Protease-Inhibitoren E64d und Pepstatin A führte zu erhöhten LC3-II-Konzentrationen sowie einer p62-Akkumulation. Im Gegensatz zu den Sigma-Rezeptor-Liganden deutet dies eher auf eine vollständige Verlaufsform hin. Da die Autophagozytose bereits nach 6 h-Behandlung mit FM 165 detektiert wurde, ist es nicht ausgeschlossen, dass es sich zunächst um eine zellschützende Funktion handeln könnte. Auch beim FM 165 scheinen oxidative Vorgänge eine wichtige Rolle hinsichtlich der Autophagozytose-Aktivierung zu übernehmen. Nach erfolgter Photoaktivierung der Zellen ließen sich ansteigende ROS Konzentrationen verzeichnen, die nach 2 h deutlich wurden und somit noch vor der Autophagozytose entstehen.
  • In the present study two different classes of potential chemotherapeutic agents were investigated for their ability to induce apoptosis and autophagy in cancer cells growing in vitro. In the first group, developed at the University of Münster in the group of Prof. Dr. Bernhard Wünsch, 39 sigma-receptor-ligands were examined for their antiproliferative activity in a panel of eight different human cancer cell lines. Based on these data structure activity relationships (SAR) were constructed showing that a bulky residue at both N-atoms of the piperazine scaffold had a positive effect on cell growth inhibition. Due to the fact that the multiple myeloma cell line RPMI 8226 possess a high level of sigma-receptors, this cell line was used for further investigations on the mechanism of cell death. The enantiomers (S)-11 and (R)-11 were used throughout these investigations as model compounds because of their affinity for both sigma-receptors and their antiproliferative activity in the RPMI 8226 cell line. It was found that both compounds induced apoptosis in the multiple myeloma in a time-dependent manner. Typical characteristics of apoptosis such as morphological changes, annexin-V positive cells and chromatin condensation were detected. The activation of caspases-3, -8 and -9 indicated an involvement of both the intrinsic and extrinsic apoptotic signaling pathways. However, by western blot analysis no cleaved caspase-9 fragments were observed, and pretreatment with the caspase inhibitors z-VAD-FMK and M50054 both failed to block apoptosis. Therefore, both sigma-receptor-ligands appear to induce apoptosis by a caspase-independent pathway, caspases playing only a minor role in initiating cell death. Moreover, the early disruption of the mitochondrial membrane potential paralleled the increasing levels of the apoptosis inducing factor (AIF) in the cytosolic fraction, further evidence that apoptosis is caspase-independent. Similar results have already been described for sigma(2)-agonists. In this work there appears to be a correlation between ¦Ò-ligands that showed cytotoxic activity and those that have affinity for the sigma(2)-receptor. In addition to apoptosis, (S)-11 and (R)-11 were also able to induce autophagy, which was first detected after the apoptotic machinery was put into action. Therefore, autophagy can not be cytoprotective but could rather be a direct cause of programmed cell death (type II). This characteristic, which has not been described for sigma-receptor-ligands to date, might give an advantage over other representatives of this class of sigma-ligands for use as anticancer drugs. Both apoptosis and autophagy appeared to be activated by lipid peroxidation (LPO). Detection of LPO generation was an early event that occurred within 1 h of treatment, and this could be suppressed by preincubation with the lipophilic antioxidant alpha-tocopherol. Notably, alpha-tocopherol diminished significantly the antiproliferative activity of (S)-11 and (R)-11 in the MTT-assay as well as the levels of annexin-V positive apoptotic cells. alpha-Tocopherol was also a potent inhibitor of autophagy, as evidenced by blockage of LC3-II-expression in western blot analysis, strengthening the idea that LPO plays a central role in programmed cell death. In a second group of potential anticancer agents, developed at the University of Warwick in the group of Prof. Dr. Peter Sadler, one photoactivatable Pt(IV)-diazide (FM165) was investigated. In contrast to the sigma-ligands, the antiproliferative activity of the photoactivatable FM165 in the HL60 human leukemia cell line could not be explained by apoptosis because the typical morphological characteristics and annexin-V positive cells were not observed. However, further investigations revealed the activation of autophagy based on the expression of LC3-II and p62 in western blot analysis. Inhibition of lysosomic enzymes with the protease inhibitors E64d and Pepstatin A led to an increased LC3-II formation as well as p62 accumulation when cells were treated with photoactivated FM165. In contrast to the ¦Ò-receptor-ligands, this data indicates a completely functional form of autophagy in HL60 cells. The early detection of autophagy after only 6 h incubation with photoactivated FM165 would appear to indicate that autophagy is cytoprotective, at least at first. Oxidative processes are also important during activation of autophagy by FM165 after photoactivation. In this case, ROS levels increased after 2 h, that is before autophagy was detected, hence their formation may be an autophagy trigger.

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Metadaten
Author: Katharina Korpis
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001783-6
Title Additional (English):Apoptosis and autophagy in cancer cells: cell death mechanisms caused by sigma-receptor-ligands and photoactivatable Pt(IV)-complexes
Advisor:Prof. Dr. Patrick J. Bednarski
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/04/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/04/08
Release Date:2014/04/11
Tag:Platin-Komplexe, Sigma-Rezeptoren
platinum-complexes, sigma-receptors
GND Keyword:Apoptose, Autophagocytose, Cytotoxizität, Photochemie
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology