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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-21729

Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe mittels zellbasierter Untersuchungen

  • Neu isolierte und synthetisierte Wirkstoffe müssen neben ihrer biologischen Wirksamkeit auch auf ihre Unbedenklichkeit für den Menschen hin untersucht werden. Ein Bestandteil der Untersuchungen zur Unbedenklichkeit ist die Prüfung auf mögliche Immuntoxizität. Die Risikobewertung und -klassifizierung von (immun-)toxischen Substanzen erfolgt derzeit in Tierversuchen, die, abgesehen von ethischen Bedenken, zeit- und kostenintensiv sind und deren Übertragbarkeit auf den Menschen nicht vollständig gewährleistet ist. Im Fokus dieser Arbeit stand die Etablierung und Anwendung eines Methodensets basierend auf funktionalen in vitro Methoden zur Charakterisierung immunologischer Wirkungen ausgewählter Naturstoffe. Dieses sollte der Beurteilung der immuntoxischen Wirkungen der getesteten Naturstoffe und der Entwicklung eines Entscheidungsbaums, der die Vorhersage des immuntoxischen Potentials mithilfe von in vitro Versuchen gestattet, dienen. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien (Jurkat-Zellen als Beispiel für T-Zellen, THP-1-Zellen als Beispiel für Monozyten) und für einige Versuche vergleichsweise primäre Blutzellen eingesetzt. Es wurden Methoden zur Untersuchung folgender Parameter etabliert und angewendet: Vitalität, Zellzyklusverteilung, Induktion von Apoptose, iROS, DNA-Schäden (Genotoxizität), Zytokinfreisetzung und mitochondriale Funktion. Folgende Naturstoffe wurden für die Untersuchungen ausgewählt: Mannitol und Urethan als Negativkontrollen, Cyclosporin A, Deoxynivalenol und Mycophenolsäure als Positivkontrollen, ausgehend von Hinweisen auf Wirkungen im Immunsystem Tulipalin A, Helenalin, Vincristin, Cannabidiol, Agaritin und p-Tolylhydrazin als Testsubstanzen. Es zeigten sich nur geringfügige Unterschiede der Substanzwirkungen zwischen den Immunzelllinien, welche v.a. auf Zytokinebene nachweisbar waren. Die Substanzen besaßen zeit- und konzentrationsabhängige Effekte. Die Negativkontrolle Mannitol hatte eine geringe Wirkung auf die Immunzelllinien, während Urethan die Zytokinfreisetzung supprimierte/¬stimulierte. Die untersuchten Positivkontrollen zeigten einen Einfluss auf die Zytokinfreisetzung und führten weiterhin zu immuntoxischen Effekten durch eine konzentrationsabhängige Apoptoseinduktion. Die Testsubstanzen Vincristin, Agaritin und p-Tolylhydrazin besaßen nur eine geringe toxische Wirkung auf die Immunzellen. Weitere Substanzen wie Cannabidiol, Helenalin und Tulipalin A wiesen immunspezifisch und - unspezifisch vermittelte Immuntoxizität durch einen Einfluss auf die Zytokinfreisetzung, Apoptose und iROS auf. Funktionale in vitro Untersuchungen zur Vitalität, Zellzyklusverteilung, Apoptose und Zytokinfreisetzung waren zum Nachweis bzw. Ausschluss von Immuntoxizität geeignet und neben Proteom- und Metabolomanalysen wesentlicher Bestandteil eines Entscheidungsbaums zur Klassifizierung von direkt immuntoxischen Substanzen. Es zeigte sich, dass die Zytokinmessung der wichtigste Parameter zur Klassifizierung von immuntoxischen Substanzen im subtoxischen Bereich ist. Es konnte sowohl Cyclosporin A als Positivkontrolle als auch Mannitol als Negativkontrolle in beiden Zelllinien bestätigt werden. Von den hinreichend untersuchten Testsubstanzen wurde Cannabidiol, Helenalin und Tulipalin A in Jurkat-Zellen sowie Cannabidiol und Tulipalin A in THP-1-Zellen unter Verwendung des Entscheidungsbaums als immuntoxisch klassifiziert. Darüber hinaus konnte die hautsensibilisierende Wirkung von Farnesol und Tulipalin A durch Anwendung von weiteren in vitro Methoden bestätigt werden. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Vorscreening Testung neuer Substanzen ermöglichen und nicht nur zu einer Reduktion von Tierversuchen führen, sondern auch eine Zeit- und Kostenersparnis bedeuten.
  • Newly isolated and synthesized active compounds have to be investigated besides their biological effectiveness on their safety for humans. One aspect of the safety evaluations is testing for possible immunotoxicity. The risk assessment and classification of (immuno-) toxic substances is currently being carried out in animal experiments which, apart from ethical concerns, are time-consuming and cost-intensive and whose transferability to humans is not fully guaranteed. The focus of this work was the establishment and application of a set of functional in vitro methods for the characterization of immunological effects of selected natural compounds. This should enable the assessment of the immunotoxic effects of the tested natural products and the development of a decision tree that allows the prediction of the immunotoxic potential. For this purpose, two human immune cell lines (Jurkat cells as an example of T cells, THP-1 cells as an example of monocytes) were used. Methods have been established to study the following parameters: viability, cell cycle distribution, induction of apoptosis, iROS, DNA damage (genotoxicity), cytokine release and mitochondrial function. The following natural products were selected for the tests: mannitol and urethane as negative controls, cyclosporin A, deoxynivalenol and mycophenolic acid as positive controls, based on indications of effects in the immune system tulipalin A, helenaline, vincristine, cannabidiol, agaritin and p-tolylhydrazine as test substances. There were only slight differences of the compounds’ effects between the immune cell lines that were mainly detectable at the cytokine level. The substances showed time- and concentration-dependent effects. The negative control mannitol had a small effect on the immune cell lines, while urethane suppressed / stimulated cytokine release. The tested positive controls showed an influence on the cytokine release and further led to immunotoxic effects through a concentration-dependent apoptosis induction. The test substances vincristine, agaritine and p-tolylhydrazine had only a slight toxic impact on the immune cells. Other substances such as cannabidiol, helenaline and tulipalin A showed immune-specific and –unspecific mediated immunotoxicity by influencing cytokine release, iROS and apoptosis. Functional in vitro studies on viability, cell cycle distribution, apoptosis and cytokine release were suitable for the detection or exclusion of immunotoxicity and in addition to proteome and metabolome analyses, an essential part of a decision tree for the classification of directly immunotoxic substances. It has been shown that cytokine measurement is the most important parameter for the classification of immunotoxic substances, investigating subtoxic concentrations. Both cyclosporin A as a positive control and mannitol as a negative control have been confirmed in both cell lines. Of the adequately investigated test substances, cannabidiol, helenaline and tulipalin A in Jurkat cells, and cannabidiol and tulipali A in THP-1 cells were classified as immunotoxic using the decision tree. In addition, the skin sensitizing effects of farnesol and tulipalin A could be confirmed by further in vitro methods. A validation of the results with other known immunotoxic and non-immunotoxic substances would allow an application as pre-screening testing of new compounds and not only lead to a reduction of animal testing, but also mean time and cost savings.

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Metadaten
Author: Nadin Schultze
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-21729
Title Additional (English):Evaluation of the immunotoxicity of selected natural compounds based on cellular assays
Referee:Prof. Dr. Ulrike Lindequist, PD Dr. Carsten Gründemann
Advisor:Prof. Dr. Ulrike Lindequist, PD Dr. Beate Haertel
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2018
Date of first Publication:2018/05/17
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2018/05/02
Release Date:2018/05/17
Tag:Immuntoxizität, Jurkat, THP-1
GND Keyword:Naturstoff, Toxizität, Zellkultur
Pagenumber:199
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie