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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002098-8

Zelluläre Mechanismen der progressiven linksventrikulären Hypertrophie - Zeitabhängige Transkriptom- und Proteomänderungen nach experimenteller Aortenstenose

  • Die chronische Herzinsuffizienz (HI) bezeichnet das Unvermögen des Herzens, die vom Körper benötigte Blutmenge bedarfsgerecht zu befördern und stellt in der Allgemeinbevölkerung das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar. Trotz großer Fortschritte in der medikamentösen Therapie ist die Prognose der HI auch heute noch schlecht. Der progrediente Verlauf erstreckt sich von einer kompensierten Herzhypertrophie mit aufrechterhaltener Pumpfunktion bis hin zu einer massiven Ventrikeldilatation mit stark eingeschränkter Herzfunktion und weist dementsprechend eine schlechte Prognose auf. Die zellulären Veränderungen auf Protein- und Genexpressionsebene während der Progression einer HI sind sehr komplex und trotz ausgiebiger wissenschaftlicher Arbeiten nicht ausreichend geklärt. Dabei ist es von entscheidender Bedeutung, in welcher Phase der Erkrankung spezifische Änderungen in der Genregulation entstehen und inwiefern sich diese auf den Phänotyp auswirken. Auf Grund dessen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit den zeitabhängigen Veränderungen auf mRNA-und Proteinebene während der Progression der HI. Um alle Stadien beginnend von einer subklinischen Organschädigung bis hin zur Ausbildung einer HI experimentell untersuchen zu können, wurde zunächst ein Mausmodell etabliert, welches durch eine chronische Nachlasterhöhung mittels Einengung des Aortenlumens eine Myokardschädigung durch eine arterielle Hypertonie simuliert (transverse aortic constriction, TAC). Die Herzfunktion der Mäuse wurde an den postoperativen Tagen 4, 14, 21, 28, 42, und 56 durch Messungen im Kleintier-MRT (Magnetresonanztomografie) evaluiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) TAC-operierter Mäuse vom postoperativen Tag 4 zu 14 verschlechtert, bis Tag 42 auf einem konstanten Niveau hält und bis Tag 56 nochmals stark absinkt. Im Gegensatz dazu zeigten Sham-operierte Mäuse über den gesamten Zeitraum eine stabile LVEF. Ein vergleichbarer stufenartiger Verlauf konnte bei den Parametern der linksventrikulären Masse und den endsystolischen bzw. enddiastolischen Volumina beobachtet werden. Zusätzlich konnte durch histologische Untersuchungen zu den verschiedenen postoperativen Zeitpunkten eine verstärkte Fibrosierung des Herzgewebes nach der TAC-OP aufgezeigt werden. Für die longitudinalen Transkriptom- und Proteomuntersuchungen wurden die Herzen (jeweils linke und rechte Ventrikel) nach den MRT-Messungen entnommen, gruppen- und zeitpunktspezifisch gepoolt und einer Microarray- bzw. massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Auf Transkriptomebene zeigten sich vor allem an den Tagen 4 und 56 starke TAC-induzierte Veränderungen im Expressionsmuster, wohingegen der Zeitraum zwischen 14 und 42 Tagen weniger differenziell exprimierte Gene aufwies. Der Verlauf der Erkrankung konnte anhand bereits bekannter Hypertrophie- und HI-marker sehr gut charakterisiert werden. So zeigten Nppa (ANP) und Nppb (BNP) im linken Ventrikel bereits kurz nach Aortenstenose stark erhöhte Expressionslevel, die über die gesamte Versuchsdauer erhalten blieben. Weiterhin wurde die Expression von Genen reguliert, die an kardialen Remodelingprozessen maßgeblich beteiligt sind, wie beispielsweise Acta1 (a-Aktin), Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) und Postn (Periostin). Im Vergleich beider Ventrikel zeigte der rechte Ventrikel bezüglich der Anzahl der regulierten Gene als auch bei der Expression HI-assoziierter Gene eine verzögerte und weniger stark ausgeprägte Reaktion. In den linken Ventrikeln wurden vor allem die Gene reguliert, deren Genprodukte der extrazelluären Matrix angehören. Eine Validierung der Microarray-Ergebnisse mittels realtime-PCR konnte die Richtigkeit der Analysemethode sehr präzise bestätigen. Da diese anhand ausgewählter Gene auf Einzeltierebene durchgeführt wurde, konnte zusätzlich auf Korrelation zwischen mRNA-Expression und den kardialen Funktionsparametern getestet werden. Wie erwartet spiegelten die Epressionslevel der HI-assozierten Markergene Nppa (ANP), Nppb (BNP) und Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) die progressive Verschlechterung der Herzfunktion wider. Zusätzlich konnten durch die Validierung und Korrelationsanalysen weitere interessante Kandidatengene, wie beispielsweise Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) und Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2) für weiterführende Studien identifiziert werden. Auch auf Proteomebene konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Auch hier zeigte der linke Ventrikel eine deutlich ausgeprägtere Reaktion auf die Drucküberlastung, der rechte Ventrikel antwortete deutlich schwächer und verzögert. Änderungen im Proteinmuster nach TAC waren in den linken Ventrikeln vor allem an den Tagen 14, 21 und 28 stark ausgeprägt. Ingenuity Pathway Analysen der veränderten Proteine weisen auf Veränderungen im Kalzium-, Rho A- und PKA-Signaling vor allem zu den frühen Zeitpunkten hin, wohingegen zu späteren Zeitpunkten hauptsächlich metabolische Prozesse betroffen waren.
  • Heart Failure (HF) presents the end-stage of many heart diseases. Its progression is characterized by a transition from a normal heart function to a compensatory hypertrophy, finally leading to decompensation and cardiac dilation. Analysis of time dependent global transcriptome and proteome changes during HF progression offers the potential to provide deeper insights in the disease development. For this analysis 8 weeks old male C57/BL6N mice underwent either TAC (transverse aortic constriction) or sham surgery. The heart function was evaluated by cardiac MRI on either day 4, 14, 21, 28, 42 and 56 after surgery (n=6 per group and time point). In TAC-mice, systolic left ventricular heart function worsened from day 4 to 14 (LV ejection fraction (LVEF) 38.2±4.3 vs. 28.3±2.9 %), remained on a stable level from day 14 to 42 (28.1±3.6 %) and showed a further pronounced decline on day 56 (16±2.2 %), whereas the LVEF of sham-mice remained unchanged (55.4±1.8 %) over time. This decrease in LVEF was paralleled by an increase in left ventricular mass, end-diastolic and end-systolic volume. The whole transcriptome of the pooled left ventricles (LV) and right ventricles (RV) of sham- and TAC-mice at each time point was analyzed by microarray technique. Microarray analysis showed that a higher number of genes were regulated (fold change (fc> ±2, TAC vs. sham) on day 4 (LV 48↑, 4↓) and 56 (LV 78↑, 9↓), while in the period between day 14 and 42, changes in gene expression pattern were less pronounced (LV 18±4↑; 4±3↓). Such alterations (fc>±2, TAC vs. sham) were more prominent in LV than in RV (125 vs. 93) over time. Common HF markers like Nppa (ANP), Nppb (BNP) and Postn (Periostin) were highly expressed at each time point. Further, genes of interest were identified and its expression as well as the expression of HF associated genes were validate on single sample level using Taq Man Low Density Array. Some candidate genes like Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) und Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2) showed stronger correlation between expression level and heart function than the examined common HF markers. Consequently, these genes have the potential to represent new research targets in HF development. To investigate changes in protein pattern during HF progression, the whole proteome of the pooled left and right ventricles of sham- and TAC-mice at each time point was analyzed by mass spectrometry (MS). MS analysis revealed that in LV the highest numbers of proteins were altered in the compensated phase at day 14, 21 and 28, whereas in RV the strongest changes occurred at the later time points. In LV, the HF associated proteins like ANP (ANF, atrial natriuretic factor); β-MHC (MYH7, myosin 7) and POSTN (Periostin) were found in higher abundance in TAC-mice already at day 4 and showed the strongest alterations at day 56. Classification of the differentially expressed proteins using Ingenuity Pathway Analysis (IPA) revealed actin based motility and calcium signaling as two of the major canonical pathways affected at all examined time points. Further, at the early time points after TAC (day 4, 14, 21), proteins associated with Rho A- and PKA-signaling displayed significant changes of their abundance in TAC- mice, whereas at day 42 and 56 metabolic pathways, including glycolysis/gluconeogenesis and pentose phosphate pathway displayed strong alterations. Taken together, this study provides an overview of changes at gene expression and protein level during HF development and offers the opportunity to distinguish between effects of TAC induced pressure overload on LV and RV. Further, new interesting research targets could be identified, which will be focused in further studies.

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Metadaten
Author: Julia Rüdebusch
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002098-8
Title Additional (English):Time dependent transcriptomic and protemic changes in Heart Failure progression after transverse aortic constriction in mice
Advisor:Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/12/19
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/10/29
Release Date:2014/12/19
Tag:Heart Failure, Proteomics, Transcriptomics
GND Keyword:Herzinsuffizienz, Proteomanalyse, Transkriptomanalyse
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie