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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000867-5

Vergleichende Charakterisierung der Transkriptionsaktivatoren Ino2 und Ino4 der Hefen Saccharomyces cerevisiae und Candida albicans

  • Die Transkription von Genen der Phospholipidbiosynthese in S. cerevisiae wird durch ein ICRE (inositol/choline responsive element) genanntes UAS-Element aktiviert, welches durch die Phospholipid-Vorstufen Inositol und Cholin (IC) gesteuert wird. ICRE-Motive werden durch ein Heterodimer der bHLH-Proteine Ino2 und Ino4 erkannt, wobei Ino2 über zwei Transkriptionsaktivierungsdomänen (TAD) die Expression vermittelt, während Ino4 dem Kernimport des Komplexes dient. Negativer Regulator ist Opi1, der mit Ino2 interagiert. SUA7 (TFIIB) wird durch die Interaktion mit Ino2 an den Promotor rekrutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen durchgeführt, um ein Heterodimer aus heterolog exprimiertem Ino2 und Ino4 über chromatographische Methoden zu reinigen. Es wurde eine affinitätschromatographische Strategie entwickelt, die es gestattet, epitopmarkiertes Ino2 und Ino4 von einem Großteil der Fremdproteine abzutrennen. Mit größeren Zellmengen könnte es künftig gelingen, ein Ino2/Ino4-Heterodimer zu reinigen und es nach Kristallisierung zusammen mit einem ICRE-Motiv einer Röntgenstrukturanalyse zugänglich zu machen. Unter Verwendung genomischer Sequenzdaten von S. cerevisiae wurden in dieser Arbeit weitere Gene identifiziert, die ICRE-Motive in ihrer Promotorregion tragen, aber keine offensichtliche Rolle bei der Phospholipidbiosynthese spielen. Untersuchungen zeigten, dass die ICRE-tragenden Gene FAR8, RSF1, YEL073C und URA8 relativ stark, die Gene ARG4, ERG20, GPD2 und VHT1 nur moderat durch IC beeinflusst werden. Für das in S. cerevisiae stark IC-abhängige INO1 Gen (50-fache Derepression bei IC-Mangel) wurde gezeigt, dass drei distinkte ICRE-Motive für diese Regulation verantwortlich sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden mit Transkriptomanalysen anderer Gruppen verglichen und die Aussagekraft von in silico-Recherchen bewertet. Candida albicans ist eine opportunistisch pathogene Hefe. Auch C. albicans ist in der Lage, Inositol, Cholin und Fettsäuren de novo zu synthetisieren. Ein Funktionshomolog zu INO1, das CaINO1, vermag eine entsprechende Nullmutation in S. cerevisiae zu komplementieren. Ebenso wurden in C. albicans die Gene CaCHO1, CaFAS1 und CaFAS2 für die Synthese von Cholin bzw. Fettsäuren identifiziert. Ferner besitzt C. albicans das dem Opi1-Protein strukturell und funktionell ähnelnde CaOpi1, welches ebenfalls in der Lage ist, eine IC-abhängige Genregulation in S. cerevisiae zu vermitteln. Die in silico Identifikation potentieller C. albicans Orthologer zu INO2 sowie zu INO4 gab Anlass zu der Annahme, dass die Regulation der Phospholipidbiosynthese in S. cerevisiae und C. albicans konserviert vorliegt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein unkonventionelles Intron im mutmaßlichen CaINO4 Gen identifiziert und durch RT-PCR eine intronfreie cDNA des CaINO4 Gens erhalten. Mit den Produkten der mu tmaßlichen Gene CaINO2 und CaINO4 wurden Protein/DNA- und Protein/Protein-Interaktionen untersucht und mit der Situation in S. cerevisiae verglichen. CaIno2 und CaIno4 sind in der Lage zu heterodimerisieren und an ICRE-Motive aus S. cerevisiae zu binden, jedoch konnte keine Bindung an den CaINO1 Promotor gezeigt werden. Weiterhin ist das Heterodimer der C. albicans-Proteine in der Lage, einer S. cerevisiae ino2 ino4 Doppelmutante ein Wachstum auf IC-freiem Medium zu ermöglichen. Keines der Gene kann jedoch allein die jeweils entsprechende ino2 oder ino4 Einfachmutation komplementieren. Weder CaIno2 noch CaIno4 interagieren mit CaOpi1, hingegen interagiert CaIno2 mit Opi1, ebenso CaOpi1 mit Ino2. Ferner interagiert CaIno2 wie auch CaIno4 mit CaSua7, nicht jedoch mit Sua7. Es konnte keine Interaktion zwischen Ino2 bzw. Ino4 mit CaIno4 bzw. CaIno2 festgestellt werden, ebensowenig eine Homodimerisierung der Proteine. Ähnlich wie Ino2 enthält auch CaIno2 zwei Transkriptionsaktivi erungsdomänen an entsprechenden Positionen und vergleichbarer Aktivierungsleistung. Es gelang im Rahmen dieser Arbeit nicht, homozygote Mutationen der Gene CaINO2 und CaINO4 durch Gendisruption in die diploide Hefe C. albicans einzuführen, es konnten lediglich heteroallele Mutanten hergestellt werden. Dieser Befund ist ein Hinweis auf eine Rolle von CaIno2 und CaIno4 bei der Aktivierung essentieller Gene in C. albicans. Daher wurde mit Genaktivierungstests nach der CaIno2/CaIno4-Konsensusbindesequenz gesucht und diese dann verwendet, um potentielle Zielgene in silico zu identifizieren. Als Konsensussequenz wurde das Motiv BWTCASRTG erhalten. Dieses Motiv wurde weder vor CaINO1, CaFAS1 oder CaCHO1 gefunden, jedoch zeigte sich eine deutliche Häufung des UAS-Elements vor mitochondrialen Genen, vor Genen der Ergosterolbiosynthese und besonders vor einer Vielzahl von Genen ribosomaler Proteine. Es kann aus diesen Daten gefolgert werden, dass CaIno2 und CaIno4 für die Aktivierung anderer, vermutlich essentieller Zielgene erforderlich sind als ihre Orthologen aus S. cerevisiae, während CaINO1 durch bisher unbekannte Faktoren reguliert wird.
  • In S. cerevisiae, structural genes of phospholipid biosynthesis are activated by an UAS element, designated ICRE (inositol/choline responsive element). This sequence motif is recognized by a heterodimer containing transcriptional activator proteins Ino2 and Ino4, both bHLH proteins. Ino2 activates transcription via two transcriptional activation domains (TADs) while Ino4 is necessary for nuclear import. Opi1 acts as a negative regulator, binding to Ino2 via its repressor interaction domain (RID). SUA7 encodes the basal transcription factor TFIIB in S. cerevisiae and is recruited to promoters by interaction with Ino2. In this work strategies were investigated to purify a heterologously expressed Ino2/Ino4 heterodimer by chromatographic methods. Development of an affinity based strategy allows separating epitope-tagged Ino2 and Ino4 from other proteins in cell lysates. After further up-scaling for larger cell amounts it should now be possible to purify an Ino2/Ino4 heterodimer and make it available for X-ray structural analysis after crystallization. Using S. cerevisiae genomic sequence data bases it was possible to identify ICRE containing promoter regions of structural genes that do not play an apparent role in phospholipid biosynthesis. It was shown that ICRE containing genes ARG4, ERG20, GPD2 and VHT1 were regulated moderately by IC while FAR8, RSF1, YEL073c and URA8 were regulated much stronger. The INO1 gene (derepression 50-fold without IC) was shown to be regulated by three distinct ICRE motifs. Results from this work were compared with those from previous genome-wide transcriptomic analyses and the validity of in silico analyses was estimated. Candida albicans is an opportunistic pathogen within the genus Saccharomycetales. C. albicans, like S. cerevisiae, is able to synthesize inositol, choline and fatty acids de novo. Gene CaINO1 functionally homologous to INO1 complements an ino1 mutant in S. cerevisiae. Further genes CaCHO1 (choline synthesis), CaFAS1 and CaFAS2 (fatty acid synthesis) were identified in previous work. C. albicans also expresses a protein structurally and functionally related to Opi1, CaOpi1. CaOpi1 is able to regulate IC-dependent gene expression in S. cerevisiae. In silico identification of putative orthologous genes for INO2 and INO4 in C. albicans suggested a possibly conserved regulation of phospholipid biosynthesis in S. cerevisiae and C. albicans. In this work a non-conventional intron was identified within a putative CaINO4 gene and intron-free CaINO4 cDNA was generated using RT-PCR. After cloning of a presumed CaINO2 gene, products CaIno2 and CaIno4 were used to investigate protein/DNA- and protein/protein-interactions which were subsequently compared with the situation in S. cerevisiae. CaIno2 and CaIno4 are able to form a heterodimer and could bind to S. cerevisiae ICRE motifs. In contrast, no interaction with the CaINO1 promoter could be shown. Expression of a CaIno2/CaIno4 heterodimer in S. cerevisiae allowed growth of a S. cerevisiae ino2 ino4 double mutant on IC free media, confirming functional complementation. However, expression of either CaINO2 or CaINO4 could not complement the corresponding single mutations in S. cerevisiae. Neither Ino2 nor Ino4 interacts with CaOpi1 but CaIno2 interacts with Opi1 from S. cerevisiae and CaOpi1 interacts with Ino2. Both CaIno2 and CaIno4 could interact with CaSua7 but not with Sua7 from S. cerevisiae. It was not possible to demonstrate interaction among Ino2 and CaIno4 and among CaIno4 and Ino2. Similarly, no evidence for the formation of homodimers containing either CaIno2 or CaIno4 could be obtained. As previ ously shown for Ino2, CaIno2 contains two transcriptional activation domains at corresponding positions with similar efficiency. Attempts to construct homozygous null mutants caino2 and caino4 in the diploid yeast C. albicans remained unsuccessful, only heteroallelic mutants could be obtained. These findings suggested that, in C. albicans, CaIno2 and CaIno4 are required for activation of genes with an essential function for cellular metabolism. Thus, activation assays were performed to identify the consensus binding sequence of the CaIno2/CaIno4 heterodimer, finally defining the sequence motif BWTCASRTG for C. albicans (compared to WYTTCAYRTG for Ino2/Ino4 from S. cerevisiae). This consensus motif was subsequently used to identify putative target genes of CaIno2/CaIno4 in silico. The motif could not be found in promoter regions of CaINO1, CaFAS1 or CaCHO1 but instead was significantly represented upstream of genes encoding mitochondrial proteins, genes of ergosterol biosynth esis and, strikingly, genes encoding ribosomal proteins. These data suggest that CaIno2 and CaIon4 are probably responsible for activation of essential target genes, functionally distinct from those regulated by Ino2/Ino4 in S. cerevisiae. Factors regulating CaINO1 have not yet been identified.

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Metadaten
Author: Jens Hoppen
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000867-5
Title Additional (English):Comparative Characterisation of Transcription Activators Ino2 and Ino4 in the Yeasts Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans
Advisor:Prof. Hans-Joachim Schüller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/11/16
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/07/19
Release Date:2010/11/16
Tag:Cholin, Genregulation, Inositol, Phospholipidbiosynthese
Choline, Gene regulation, Inositol, Phospholipid biosynthesis
GND Keyword:Candida albicans, Derepression, Genregulation, Promotor <Genetik>, Repression <Genetik>, Saccharomyces cerevisiae
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie