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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001546-4

Optimization of Bacillus subtilis as an expression system

  • Bacteria are an integral part of modern biotechnology. They are used to make a variety of products, such as foods, drugs, as well as a multitude of chemicals. In order to increase their production rates molecular biotechnology offers many tuning points, starting from the selection of an applicable host, over its geno- and phenotypical characterization, followed by genetic manipulations for an optimized metabolism and stabilisation of production processes. This work comprises the optimization of Bacillus subtilis as an expression system. It describes the steps taken for selection and genomic characterization of the B. subtilis wild type strain ATCC 6051, the subsequent optimizations of the strain in respect to growth and productivity, as well as the characterization of its behaviour in a variety of cultivation conditions. The B. subtilis strain most commonly found in laboratories around the world is the first sequenced Gram-positive organism B. subtilis 168. Zeigler et al. showed that strain 168 is not a real wild type. Instead it was created through random mutagenesis with X-rays and selected for transformability. This strain has been used as the basis for popular B. subtilis strains in heterologous gene expression such as the extracellular protease deficient WB strains. Growth experiments showed the real wild type strain ATCC 6051 to be superior to its mutated ancestor 168, making it a solid basis for the construction of an optimized B. subtilis expression system. In order to gain a full understanding of the genomic and corresponding physiological differences between the two systems, B. subtilis ATCC 6051 was sequenced and compared to the genome of B. Subtilis 168. Several variations on geno- and phenotypic level could be revealed, that resulted in particular from genes involved in natural competency, the metabolism of amino acids and chemotaxis. This genomically well characterized B. subtilis ATCC 6051 was improved in respect to its application as an expression host. Improvements were achieved through the inactivation of both sporulation and reduction of autolysis, leading to a more robust behaviour during the overproduction and secretion of a reporter enzyme. A positive effect on the activity of an acetoin induced promoter by the addition of second copies for its transcription factors SigmaL and AcoR could be observed. Anaerobic zones and areas with excess glucose caused by insufficient mixing are common conditions in large scale bioprocesses and lead to oscillating conditions for the cells. In turn, this oscillation provokes an excretion of so called overflow metabolites, which can negatively affect the bacterial productivity. Detailed scientific characterizations of industrial scale processes under such oscillating conditions are scarce due to the high costs and logistics involved. A B. Subtilis sporulation mutant was thus examined in respect to its extra- and intracellular metabolites in a scale-down, two-compartment reactor giving hints about conditions the host is exposed to and how it reacts. To improve tolerance thresholds and utilization capacity for such metabolites in B. subtilis, the glyoxylate cycle was transferred from its close relative Bacillus licheniformis into the genome of B. subtilis. This feature enabled our B. subtilis ACE mutant to grow on acetate. The improved strain showed higher tolerance towards excess glucose in a fed-batch as well as higher productivity during the expression of a reporter enzyme in comparison to the wild type. The ACE strain and B. licheniformis showed an increased formation of glycolate during growth with the glyoxylate cycle. This with regard to bacteria undescribed metabolite seems to play a role as a by-product of the glyoxylate cycle. Summarizing, this thesis deals with the characterization and optimization of B. subtilis for growth on overflow metabolites, enhancements of the acoA-expression system and the influence of sporulation and lysis mutants on its activity. Complementary, the host was begun to be characterized in respect to its behaviour in industrial scale processes.
  • Bakterien sind ein integraler Bestandteil der modernen Biotechnologie. Sie werden zur Herstellung verschiedenster Produkte verwendet, von Lebensmitteln über Medikamente sowie einer Vielzahl von Chemikalien. Zur Erhöhung ihrer Produktionsraten bietet die molekulare Biotechnologie viele Stellschrauben. Diese bestehen in der Auswahl eines möglichen Wirts bis hin zur geno- und phänotypischen Charakterisierung gefolgt von genetischen Manipulationen zur Optimierung des Stoffwechsels und der Stabilität in Produktionsprozessen. Diese Arbeit umfaßt die Optimierung von Bacillus subtilis als Expressionssystem. Es werden die Schritte zur Auswahl und genomischen Charakterisierung des B. subtilis Wildtyp-Stamm ATCC 6051, die nachfolgenden Optimierungen in Bezug auf Wachstum und Produktivität sowie eine Charakterisierung des Wirts unter Fed-Batch-Bedingungen im industriellen Maßstab beschrieben. Der in den meisten Laboren der Welt verwendete B. subtilis Stamm ist der erste sequenzierte Gram-positive Organismus B. subtilis 168. Zeigler et al. zeigten, dass Stamm 168 kein echter Wildtyp ist, sondern ein durch Zufalls-Mutagenese mit Röntgenstrahlen verändertes Bakterium, welches auf eine erhöhte Transformierbarkeit hin selektiert wurde. Dieser Stamm bildet auch die Grundlage für populäre B. subtilis Stämme, wie zum Beispiel die protease defizienten WB-Stämme , welche in der heterologen Genexpression und Produktion Verwendung finden. Wachstumsexperimente zeigten ein besseres Wachstum des Wildtyp Stamms ATCC 6051 gegenüber seinem mutierten Nachfahren B. subtilis 168, so dass der Stamm ATCC 6051 eine gute Alternative für die Konstruktion eines optimierten B. subtilis Expressionssystems darstellt. Um ein möglichst lückenloses Verständnis und eine solide Basis für die Konstruktion eines Expressions Stamms zu erhalten, wurde B. subtilis ATCC 6051 sequenziert und mit dem Genom des bereits sehr gut charakterisierten B. subtilis 168 hinsichtlich der Unterschiede auf genotypischer und phänotypischer Ebene untersucht. Es konnten eine Reihe von Abweichungen in Bezug auf die natürliche Kompetenz, auf den Stoffwechsel der Aminosäuren und die Chemotaxis festgestellt werden. Mit dem B. subtilis ATCC 6051 als Ausgangs Stamm wurden Optimierungen durch die Inaktivierung der Sporulation sowie einer Reduktion der Autolyse durchgeführt. Die Inaktivierung der entsprechenden Gene führte zu einem robusteren Verhalten während der Überproduktion und Sekretion eines Reporterenzyms. Eine positive Wirkung auf die Aktivität eines Acetoin induzierten Promotors konnte durch die Integration zusätzlicher Kopien seiner Transkriptionsfaktoren SigmaL und AcoR beobachtet werden. Sauerstoffmangel und Zonen mit einem Überschuss an Glu kose aufgrund unzureichender Durchmischung führen zu oszillierenden Bedingungen in industriellen Bioprozessen. Diese Bedingungen führen zur Exkretion von so genannten Überlauf Metaboliten (overflow metabolites), die sich negativ auf die Produktivität auswirken können. Auf Grund der hohen Kosten und dem Umfang der involvierten Logistik gibt es bislang kaum wissenschaftliche Untersuchungen von Bioprozessen im industriellen Maßstab. Daher wurde eine B. subtilis sporulations-Mutante auf ihre extra-und intrazellulären Metabolite während einer Kultivierung in einem maßstabsverkleinerten Bio-Reaktor untersucht. Damit entstehende Überlauf-Metabolite von B. subtilis besser toleriert und verwendet werden können, wurde der Glyoxylatzyklus aus seinem nahen Verwandten Bacillus licheniformis in das Genom von B. subtilis transferiert. Dadurch konnte diese B. subtilis ACE Mutante mit Azetat als C-Quelle wachsen. Der verbesserte Stamm zeigt im Vergleich zum Wildtyp eine höhere Toleranz gegenüber überschüssiger Glukose in einem Fed-Batch und eine erhöhte Produktivität bei der Expression eines Reporter-Enzyms. Für den ACE-Stamm und B. licheniformis konnte ein Anstieg von Glykolat während des Wachstums mit dem Glyoxylatzyklus festgestellt werden. Dieser für Bakterien bisher kaum beschriebene Metabolit könnte eine wichtige Rolle als Zwischenprodukt des Glyoxylatzyklus darstellen. Zusammenfassend behandelt diese Arbeit die Charakterisierung und Optimierung von B. subtilis für das Wachstum auf Überlauf-Metaboliten, die Erhöhung der Expression durch das acoA-Expressionssystem und den Einfluss einer Sporulations- und Lysemutante auf dessen Aktivität. Komplementiert wird dieses optimierte Expressionssystem durch die Untersuchung des Effekts von Kultivierungen im industriellen Maßstab auf den Stoffwechsel von B. subtilis anhand eines „scale-down“ Experiments.

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Metadaten
Author: Johannes Fritz Kabisch
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001546-4
Title Additional (German):Optimierung von Bacillus subtilis als Expressionssystem
Advisor:Prof. Dr. Wolfgang Liebl, Prof. Dr. Thomas Schweder
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2013/07/16
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/05/24
Release Date:2013/07/16
Tag:Bacillus subtilis, Glyoxylat, Glyoxylatzyklus
Bacillus subtilis, metabolic engineering
GND Keyword:Acetate, Acetoin, Bacillus, Bakterien, Biotechnologie, Gentechnologie, Heubacillus, Molekularbiologie, Plasmid
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie