Open Access

Lara Pfaff

• This thesis deals with the characterisation and engineering of new thermophilic PET hydrolases as potential candidates for an eco-friendly biocatalytic recycling approach for the upcycling or downcycling of polyethylene terephthalate (PET) on industrial scale. Furthermore, high-throughput screening methods are described that detect the products of PET hydrolysis. The high demand of PET in the packaging and textile industries with a global production of 82 million metric tons per year has significantly contributed to the global solid waste stream and environmental plastic pollution after its end-of-life. Although PET hydrolases have been identified in various microorganisms, only a handful of benchmark enzymes have been engineered for industrial applications. Therefore, the identification of new PET hydrolases from metagenomes or via protein engineering approaches, especially thermophilic PET hydrolases with optimal operating temperatures (i.e., increased thermostability and activity) near the glass transition temperature of the polymer PET, is a crucial step towards a bio-based circular plastic economy. Article I demonstrates that metagenome-derived thermophilic PET hydrolases can be significantly improved using different engineering approaches to achieve a similar activity level as the well-established leaf-branch-compost cutinase (LCC) F243I/D238C/S283C/Y127G variant (LCC ICCG). In Article II, thermostable variants of a mesophilic enzyme (PETase from Ideonella sakaiensis) were identified from a mutant library and characterised against PET substrates in various forms. Articles III and IV describe the application of high-throughput methods for the identification of novel PET hydrolases by directly assaying terephthalic acid (TPA), one of the monomeric building blocks of PET. Furthermore, Article IV describes the possibility of a one-pot conversion of the TPA-based aldehydes produced to their diamines as example for an open-loop upcycling method.
• Diese Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung und dem Engineering neuer thermophiler PET-Hydrolasen als potenzielle Kandidaten für einen umweltfreundlichen biokatalytischen Recyclingansatz für das Upcycling oder Downcycling von Polyethylenterephthalat (PET) im industriellen Maßstab. Darüber hinaus werden Hochdurchsatz-Screening-Methoden beschrieben, mit denen die Produkte der PET-Hydrolyse nachgewiesen werden können. Die hohe Nachfrage nach PET in der Verpackungs- und Textilindustrie mit einer weltweiten Produktion von 82 Millionen Tonnen pro Jahr hat erheblich zu den weltweiten Abfallströmen und der Umweltverschmutzung durch Kunststoffe nach dem Ende ihrer Lebensdauer beigetragen. Obwohl PET-Hydrolasen in verschiedenen Mikroorganismen identifiziert wurden, sind nur eine Handvoll von Referenzenzymen für industrielle Anwendungen entwickelt worden. Daher ist die Identifizierung neuer PET-Hydrolasen aus Metagenomen oder durch Protein Engineering, insbesondere thermophiler PET-Hydrolasen mit optimalen Arbeitstemperaturen (d. h. mit einer erhöhter Thermostabilität und Aktivität) nahe der Glasübergangstemperatur des Polymers PET, ein entscheidender Schritt auf dem Weg zu einer biobasierten Kreislaufwirtschaft für Kunststoffe. In Artikel I wird gezeigt, dass aus Metagenomen abgeleitete thermophile PET-Hydrolasen mit verschiedenen Engineering- Ansätzen deutlich verbessert werden können, um ein ähnliches Aktivitätsniveau zu erreichen wie die gut etablierte Blatt-Zweig-Kompost-Cutinase (LCC) F243I/D238C/S283C/Y127G-Variante (LCC ICCG). In Artikel II wurden thermostabile Varianten eines mesophilen Enzyms (PETase aus Ideonella sakaiensis) aus einer Mutantenbibliothek identifiziert und gegen PET-Substrate in verschiedenen Formen charakterisiert. In den Artikeln III und IV wird die Anwendung von Hochdurchsatzmethoden zur Identifizierung neuartiger PET-Hydrolasen durch den direkten Nachweis von Terephthalsäure (TPA), einem der monomeren Bausteine von PET, beschrieben. Darüber hinaus wird in Artikel IV die Möglichkeit einer Eintopf-Umwandlung der erzeugten TPA-basierten Aldehyde in ihre Diamine als Beispiel für ein offenes Upcycling-Verfahren beschrieben.