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Baeyer-Villiger monooxygenases involved in camphor degradation

  • In this thesis, all three BVMOs from Pseudomonas putida NCIMB10007, that were known to be responsible for the ability of this strain to degrade camphor since the 1950s were successfully made available as recombinant biocatalysts. While the genomic sequence of 2,5-DKCMO was available from the database, the genes encoding 3,6-DKCMO and OTEMO had to be identified using certain PCR-techniques first. All three enzymes were cloned into standard plasmids enabling convenient expression in E. coli facilitating the application of the enzymes in organic chemistry. Their synthetic potential was already reported during the 1990s, but at that time their efficient application was limited due to difficulties with respect to low production levels and insufficient purity and separation of enzyme fractions. These drawbacks are now overcome. Furthermore, biochemical characterization of the camphor-degrading BVMOs was performed including the substrate spectra of these enzymes. Thereby OTEMO turned out not only to have a broad substrate scope accepting mono- and bicyclic aliphatic and arylaliphatic ketones, but also to efficiently convert alpha/beta-unsaturated cycloalkanones due to the similarity of these compounds to OTEMOs natural substrate. Finally, the major limitation in the synthetic application of Type II BVMOs was addressed by searching a flavin-reductase suitable for coupling to these two-component oxygenases. Putative candidates from the respective P. putida strain were identified by the use of amino acid motifs conserved in other representatives of two-component systems. While these enzymes failed, flavin-reductase Fre from E. coli - that also contained the motifs - was shown to enhance the activity of the DKCMOs when applied as crude cell extract as well as pure enzyme. This finding represents a key step for future application of Type II BVMOs.
  • In dieser Doktorarbeit ist es gelungen, alle drei BVMOs aus Pseudomonas putida NCIMB 10007, von denen seit den 1950er Jahren bekannt ist, dass sie am mikrobiellen Abbau von Camper beteiligt sind, als rekombinante Biokatalysatoren zur Verfügung zu stellen. Während die genomische Sequenz der 2,5-DKCMO in der NCBI-Datenbank erhältlich war, mussten die Gene, die die 3,6-DKCMO und die OTEMO kodieren zunächst mit Hilfe von PCR-Techniken identifiziert werden. Alle drei Enzyme wurden anschließend in Standard-Plasmide kloniert, die ihre Expression in E. coli erlaubten. Dies sollte die Anwendung der Enzyme in der organischen Chemie ermöglichen. Das synthetische potential dieser Enzyme wurde bereits in den 1990er Jahren untersucht, aber damals war ihre effiziente Anwendung durch Schwierigkeiten bezüglich ihrer Herstellung in größeren Mengen und zufriedenstellender Reinheit, sowie ausreichender Trennung der Enzyme voneinander, limitiert. Diese Schwierigkeiten sind nun überwunden. Weiterhin wurde die biochemische Charakterisierung der Campher-abbauenden BVMOs durchgeführt, einschließlich der Substrat-Spektren der Enzyme. Dabei zeigt such, dass OTEMO nicht nur ein breites Spektrum an Substraten wie mono- und bizyklische, aliphatische und arylaliphatische Ketone akzeptiert. Weiterhin setzte sie effizient alpha/beta-ungesättigte Zykloalkanone um, die Ähnlichkeiten zum natürlichen Substrat des Enzyms aufweisen. Schließlich widmete sich diese Doktorarbeit der größten Einschränkung in der Anwendung von Typ II BVMOs, der Notwendigkeit einer zusätzlichen Flavin-Reduktase zur Versorgung der Oxygenase mit reduziertem Flavin. Zunächst wurden mit Hilfe von Aminosäuremotiven, die in anderen Zwei-Komponenten-Monooxygenase-Systhemen konserviert sind, Flavin-Reduktasen aus P. putida identifiziert. Diese Enzyme waren jedoch nicht geeignet, um mit den DKCMOs zusammenzuarbeiten. Stattdessen wurde die Flavin-Reduktase Fre aus E. coli, die ebenfalls die genannten Motive enthält, verwendet, um die Aktivität der DKCMOs gegenüber ihren Substraten zu steigern. Dies wurde in dieser Arbeit sowohl für die Verwendung von Enzym-Rohextrakten als auch aufgereinigten Enzymen gezeigt und stellt einen wichtigen Schritt in der zukünftigen Anwendung der Typ II BVMOs dar.

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Metadaten
Author: Maria Kadow
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001376-8
Title Additional (German):Die am Abbau von Campher beteiligten Baeyer-Villiger Monooxygenasen
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2013/01/04
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/12/13
Release Date:2013/01/04
Tag:Baeyer-Villiger monooxygenase, diketocamphane monooxygenase, flavin reductase
GND Keyword:Baeyer-Villiger-Oxidation, Biokatalyse, Campher, Enzymkatalyse, Flavine, Monooxygenasen, Pseudomonas putida
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie