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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001438-4

Untersuchungen zu rekombinanten eukaryotischen Baeyer-Villiger-Monooxygenasen

  • Im Rahmen dieser Dissertation wurden Gene von Baeyer-Villiger-Monooxygenasen (BVMOs) aus Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011 identifiziert und die Enzyme im Vergleich mit prokaryotischen BVMOs charakterisiert. Ziel dabei war es, das enzymatische Potenzial dieses filamentösen Pilzes bezüglich der biokatalytischen Baeyer-Villiger-Oxidation zu evaluieren. Da das Genom von C. radicicola nicht sequenziert war, wurden zur Auffindung neuer BVMO-Sequenzen Methoden der Proteinaufreinigung sowie eine Identifizierung über molekularbiologische Ansätze angestrebt. Die BVMO konnte jedoch nicht über eine Aufreinigung aus dem Zellextrakt von C. radicicola, unter Anwendung eines dreistufigen Reinigungsprotokolls, in der für nachgelagerte Untersuchungen erforderlichen Reinheit gewonnen werden. Aus diesem Grund erfolgte die Identifizierung von BVMO-Sequenzen mit Hilfe molekularbiologischer Methoden. Mit degenerierten Primern, welche konservierte Sequenzbereiche bekannter BVMOs enthielten und über die CODEHOP-Strategie abgeleitet wurden, konnten drei zu BVMOs homologe Sequenzfragmente amplifiziert und identifiziert werden. Zwei der Sequenzen waren homolog zu putativen pilzlichen Steroidmonooxygenasen (STMOs). Durch Sequenzvergleiche konnte gezeigt werden, dass diese Sequenzen vermutlich kryptische Gene darstellen. Aus diesem Grund erfolgten keine weiteren Untersuchungen zu diesen zwei Sequenzen. Es gelang jedoch, eine der aus C. radicicola neu identifizierten Sequenzen funktionell in E. coli überzuexprimieren, wobei diese in weiteren Untersuchungen als Cycloalkanonmonooxygenase (CAMO) identifiziert werden konnte. Die Primärstruktur dieser BVMO besteht aus 531 Aminosäureresten, welche ca. 45% Sequenzidentität zu bekannten Cyclohexanonmonooxygenasen (CHMOs) aufweisen. Die Expression des mit aminoterminalem Hexahistidintag fusionierten Proteins wurde erfolgreich auf einen 20-Liter-Maßstab vergrößert und die CAMO nachfolgend aufgereinigt. Die CAMO weist ein breites Substratspektrum auf, wobei ein Umsatz vieler cycloaliphatischer und bicycloaliphatischer Ketone ermittelt werden konnte. Dabei ist die hohe katalytische Effizienz gegenüber Cyclobutanon als eine besondere Eigenschaft dieser BVMO hervorzuheben. Für die CAMO konnte kein Umsatz von Steroiden ermittelt werden. Neben der Oxygenierung von Cycloalkanonen konnte für das Enzym eine Aktivität gegenüber offenkettigen Ketonen wie Cyclobutyl-, Cyclopentyl- und Cyclohexylmethylketon nachgewiesen werden. Die neu beschriebene eukaryotische BVMO katalysiert folglich Reaktionen, die bisher für viele prokaryotische BVMOs - so insbesondere CHMOs - nicht beschrieben wurden. Die nachgewiesene Fähigkeit von C. radicicola, mit Cyclohexanon als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen, deutet auf eine katabole Funktion der Umsetzung von Cycloalkanonen hin. Diese Eigenschaft ist für Sanierungsverfahren mineralölbelasteter Umweltkompartimente von Bedeutung und war bisher nur für wenige Pilze bekannt. Da bisher keine BVMOs aus eukaryotischen Organismen rekombinant hergestellt wurden, stellt die im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich durchgeführte rekombinante Expression der CAMO aus C. radicicola das erste Beispiel für ein derartiges Enzym dar. Für einen Großteil der für C. radicicola beschriebenen biokatalytischen Fähigkeiten ist eine Steroidmonooxygenase (STMO) von besonderer Bedeutung. Daher wurde zu Vergleichszwecken das Substratspektrum einer STMO aus Rhodococcus rhodochrous DSM 43269 analysiert. Hierbei konnte erstmals gezeigt werden, dass dieses Enzym neben Steroiden auch weitere offenkettige Ketone wie Cyclopentyl- und Cyclohexylmethylketon umsetzt. Besonders interessant war dabei die nachgewiesene STMO-katalysierte Oxygenierung von Cyclobutanonderivaten, da das Enzym mit Ausnahme dieser Substratgruppe nur lineare Ketone umsetzt. Da sowohl für die CAMO aus C. radicicola als auch für die STMO aus R. rhodochrous ein Umsatz von Cyclobutanonderivaten nachgewiesen werden konnte, wurde deren Enantioselektivität in Biokatalysen mit dem Substrat 3-Phenylcyclobutanon untersucht und mit der CHMO aus Acinetobacter calcoaceticus verglichen. Die CAMO zeigte dabei eine höhere Enantioselektivität als die CHMO. Dagegen ist die STMO enantiodivergent zur CHMO und weist eine höhere Enantioselektivität als bisher bekannte (S)-selektive BVMOs auf. Die untersuchten BVMOs bieten somit ein hohes Potenzial im Bereich der Herstellung chiraler Butyrolactonderivate, welche wertvolle Bausteine für die Naturstoffsynthese darstellen. Ein weiterer Aspekt lag in der Erweiterung des Substratspektrums der STMO aus R. rhodochrous über rationales Protein-Design, um so ein tieferes Verständnis der Sequenz-Aktivitäts-Beziehungen zu gewinnen. Basierend auf Ergebnissen der Literatur bezüglich Mutanten der zu dieser STMO homologen Phenylacetonmonooxygenase aus Thermobifida fusca wurden Varianten der STMO aus R. rhodochrous erzeugt. Für diese konnte jedoch kein erweitertes Substratspektrum ermittelt werden.
  • In this thesis, Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO) genes from Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011 were identified and the corresponding enzymes characterized in comparison to prokaryotic BVMOs. Thus, one aim of this work was an evaluation of the enzymatic capability of this filamentous fungus with regard to the biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation. Due to the fact that the genome of C. radicicola has not been sequenced yet, methods of protein purification as well as identification via molecular biological approaches were pursued for the discovery of new BVMO sequences. However, the application of a three-step purification protocol used for the cell-free extract of C. radicicola did not result in protein of sufficient purity which was mandatory for subsequent investigations. Therefore, the identification of BVMO sequences was carried out based on molecular biological methods. Using degenerate primers based on conserved sequence motifs of known BVMOs, and which were derived by means of the CODEHOP approach, three sequences homologous to BVMOs were successfully amplified and identified. Two of the identified sequences were homologous to putative steroid monooxygenases (STMOs) from fungal origins. However, these sequences were assigned as putative cryptic genes based on sequence comparison. For this reason, no further studies were carried out on these two sequences. However, one of the sequences newly identified from C. radicicola was functionally overexpressed in E. coli successfully. The enzyme was characterized as a cycloalkanone monooxygenase (CAMO) through further investigations. The primary structure of this BMVO comprises 531 residues revealing around 45% sequence identity to known cyclohexanone monooxygenases (CHMOs). The recombinant expression of the protein fused to an aminoterminal hexahistidine tag was successfully upscaled to a 20 liter scale and the CAMO subsequently purified. The CAMO exhibits a broad substrate scope and conversion of a variety of cycloaliphatic and bicycloaliphatic ketones was determined. A high catalytic efficiency against cyclobutanone was observed and has to be pointed out as a particular property of this BVMO. However, no conversion of steroids was detected for the CAMO. Besides the oxygenation of cycloalkanones, the enzyme revealed activity towards open-chain ketones such as cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl methyl ketone. Therefore, the eukaryotic BVMO newly characterized in this work catalyzes reactions which have not been described for many prokaryotic BVMOs, particularly not for CHMOs. The capability of the strain C. radicicola to grow on cyclohexanone as the sole source of carbon and energy suggests a catabolic role in the conversion of cycloalkanones. This capacity is significant for remediation of mineral oil-contaminated environmental areas, and has been rarely described for fungi in literature. Since no BVMOs from eukaryotic organisms have been produced recombinantly so far, the successful recombinant expression of the CAMO in this study provides the first example for such an enzyme. The biocatalytic capabilities described in literature for C. radicicola are mainly based on a steroid monooxygenase (STMO). For this reason, the substrate spectrum of a STMO from Rhodococcus rhodochrous DSM 43269 was analyzed for comparative purposes. These investigations showed for the first time that this enzyme also converts other open-chain ketones such as cyclopentyl and cyclohexyl methyl ketone. The STMO-catalyzed oxygenation of cyclobutanone derivatives was of particular interest as this enzyme only converts open-chain ketones except for this substrate group. As conversion of cyclobutanone derivatives was established for the CAMO from C. radicicola as well as for the STMO from R. rhodochrous, the enantioselectivity of both enzymes was investigated through biocatalytic reactions using the substrate 3-phenylcyclobutanone and compared to the values measured for the CHMO from Acinetobacter calcoaceticus. Results showed that the CAMO exhibits a higher enantioselectivity compared to CHMO. In contrast, the STMO was shown to be enantiodivergent when compared to the CHMO, and exhibits a higher enantioselectivity than previously known (S)-selective BVMOs. Thus, the BVMOs investigated in this study open up great potential for the production of chiral butyrolactone derivatives which constitute valuable building blocks for the synthesis of natural products. A further aspect of this thesis was the enhancement of the substrate scope of the STMO from R. rhodochrous by means of rational protein design, for gaining a deeper understanding of the sequence-activity relationship. For this purpose, mutants of the STMO from R. rhodochrous were generated based on results from literature relating to variants of phenylacetone monooxygenase from Thermobifida fusca, for which the sequence is homologous to the STMO. However, no enhanced substrate scope was determined for these mutants.

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Metadaten
Author: Friedemann Leipold
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001438-4
Title Additional (English):Investigation of recombinant eukaryotic Baeyer-Villiger monooxygenases
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2013/04/08
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/12/17
Release Date:2013/04/08
Tag:CODEHOP, Cycloalkanonmonooxygenase, Cylindrocarpon radicicola, Steroidmonooxygenase, rationales Proteindesign
Baeyer-Villiger monooxygenase, cycloalkanone monooxygenase, heterologous gene expression, rational protein design, substrate specificity
GND Keyword:Baeyer-Villiger-Oxidation, Butyrolactonderivate, Enzymkatalyse, Heterologe Genexpression, Monooxygenasen, Rhodococcus rhodochrous, Substratspezifität
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie