• search hit 1 of 3
Back to Result List

Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002343-6

An artificial enzyme cascade for the biocatalytic synthesis of polymer building blocks

  • In this thesis an artificial enzyme cascade consisting of an ADH from Lactobacillus kefir, a CHMO from Acinetobacter sp. NCIMB 9871 and lipase A from Candida antarctica has been investigated for the biocatalytic synthesis of the bulk chemical ε-caprolactone as well as several derivatives for their direct utilization as polymer building blocks. Due to major limitations, which hamper such a biocatalytic route, the first addressed demand in this work was the improvement of the stability of the CHMO. By structure-guided engineering, distinctively improved variants concerning the resistance against oxidation as well as temperature stability without compromising the catalytic activity were successfully created. Due to the incomplete knowledge of the mechanisms that lead to thermal and/or oxidative inactivation of enzymes, this study illustrates that the selection of mutations for increased protein stability is still hard to predict. Thus, these results can serve as a basis for further stability studies on this enzyme class to give better insights into the underlying mechanisms, which determine the stability of an enzyme. Such a highly stabilized biocatalyst will pave the way for the successful use of flavin-dependent enzymes for industrial applications. A further aim of this thesis was dedicated to the second major hurdle en route to polyester precursors represented by the product inhibition and enzyme deactivation caused by ε-caprolactone, particularly at higher concentrations. To overcome this limitation, we developed an elegant solution in which the ε-caprolactone produced by the one-pot two-step enzymatic method is directly subjected to ring-opening polymerization using the unique lipase A from Candida antarctica. Applying this enzyme cascade in a whole cell biocatalysis in combination with an improved cofactor regeneration approach, the problem of product inhibition problem was efficiently solved leading to the formation of oligo-ε-caprolactone at more than 20 g/L when starting from 200 mM cyclohexanol. By a process development approach through solvent engineering it was found that biotransformations proceed much faster in an isooctane-containing biphasic solvent system when using free enzymes. Finally, the improved enzyme cascade was applied for the synthesis of chiral substrates and provided access to functionalized chiral compounds in high yields (up to >99%) and optical purities (up to >99%ee). By subsequent enzymatic enantioselective ring-opening of the enantiopure monomers, oligomeric lactones were successfully synthesized, which can be directly serve as building blocks for the polymer industry.
  • Diese Doktorarbeit beschreibt die Untersuchung einer artifiziellen Enzymkaskade bestehend aus einer ADH aus Lactobacillus kefir, einer CHMO aus Acinetobacter sp. NCIMB 9871 und Lipase A aus Candida antarctica bezüglich der biokatalytischen Synthese der Bulkchemikalie ε-Caprolakton, sowie weiteren Derivaten für deren Anwendbarkeit als Polymervorstufen. Aufgrund zahlreicher Limitationen, die einen solchen biokatalytischen Weg bisher verhindern, war das erste Ziel dieser Arbeit die Generierung einer stabilisierten Variante der CHMO. Mittels einer Struktur-basierten Veränderung dieses Enzyms konnten deutlich verbesserte Varianten in Bezug auf eine erhöhte Stabilität gegenüber Oxidation, aber auch gegenüber höheren Temperaturen generiert werden, ohne die katalytische Effizienz des Enzyms signifikant zu beeinflussen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war der zweiten großen Herausforderung auf dem Weg zur biokatalytischen Synthese von Polyestervorstufen gewidmet, nämlich der Produktinhibierung der CHMO vor allem bei höheren Konzentrationen. Diese Produktinhibierung, ausgelöst durch ε-Caprolakton, kann zu einer Enzyminaktivierung führen. Um diese Limitation zu überwinden, wurde eine elegante Lösung entwickelt, bei der die direkte Ringöffnungs-Oligomerisierung des in situ gebildeten ε-Caprolakton in wässriger Phase unter Nutzung der Lipase A aus Candida antarctica von entscheidender Bedeutung war. So wurde das Problem der Produktinhibierung gelöst, und Oligo-ε-Caprolakton wurde mit >20 glL ausgehend von 200 mM Cyclohexanol erhalten. Dieses Oligomer konnte chemisch leicht zu PCL polymerisiert werden. Mittels einer weiteren Prozess-Entwicklungsstrategie durch ein sogenanntes Lösungsmittel-Engineering konnte gezeigt werden, dass Biotransformationen sehr viel schneller unter Einsatz eines Isooktan-haltigen organischen Zweiphasensystems bei Nutzung freier Enzyme erfolgen. Schließlich wurde die verbesserte Enzymkaskade auf die biokatalytische Synthese von chiralen Oligoestern angewendet. Dabei konnte erfolgreich gezeigt werden, dass funktionalisierte chirale Verbindungen in hohen Ausbeuten (bis zu > 99 %) und hohen optischen Reinreiten (bis zu > 99 %) synthetisiert werden konnten. Durch eine nachfolgende enzymatische und enantioselektive Ring-Öffnung der enantioreinen Monomere konnten chirale Oligoester erfolgreich synthetisiert werden. In industriellem Maßstab wird Poly-e-caprolacton (PCL) gegenwärtig nur chemisch produziert, wobei mit Peressigsäure ein gefährliches Reagens als Oxidationsmittel genutzt wird. Baeyer-Villiger-Monooxygenasen (BVMOs) ermöglichen im Prinzip die enzymatische Synthese von e- Caprolacton (e-CL) direkt ausgehend von Cyclohexanon mit molekularem Sauerstoff, doch gegenwärtige Systeme leidenunter niedriger Produktivität sowie Substrat- und Produktinhibierung. Wir überwanden wesentliche Imitationen eines solchen biokatalytischen Wegs durch die Kombination einer Alkoholdehydrogenase mit einer BVMO für die effiziente Oxidation von Cyclohexanol zu e-CL. Entscheidend war die direkte Ringçffnungs-Oligomerisierung des in situ gebildeten e-CL in wässriger Phase unter Nutzung der Lipase A aus Candida antarctica. So wurde das Problem der Produktinhibierung gelöst, und Oligo-e-CL wurde mit >20 gl1 ausgehend von 200 mm Cyclohexanol erhalten. Dieses Oligomer konnte chemisch leicht zu PCL polymerisiert werden.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Sandy Schmidt
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002343-6
Title Additional (German):Eine artifizielle Enzymkaskade zur biokatalytischen Synthese von Polymervorstufen
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2015/10/29
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/10/26
Release Date:2015/10/29
GND Keyword:Caprolacton <epsilon->, Cyclohexanon-Monooxygenase, Enzymkatalyse, Lipase, Polycaprolactone
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie