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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002455-3

In vivo silencing of A20 via TLR9-mediated targeted siRNA delivery potentiates anti-tumor immune response

  • Cancer is one of the leading causes of death in industrialized nations. Nowadays, cancer therapy mainly consists of surgery, radiation and chemotherapy. Thanks to intensive research alternative treatment strategies like gene therapy and especially immunotherapies are on the rise. Immunotherapies base on the idea of stimulating and supporting the patients immune system to generate an effective anti-tumor immune response. Dendritic Cells are perfect targets for this purpose, since these potent antigen-presenting immune cells influence the balance of the immune system by defining the route of action. Stimulation of these cells by activation of cellular signaling pathways results in maturation, upregulation of surface molecules and secretion of cytokines. A20 has been identified as a regulator of dendritic cell maturation and attenuator of their immune stimulating properties. Hence, the blockade of that natural inhibitor reveals an elegant way to activate cellular pathways of DCs. A siRNA against A20 obtains a functional blockade via RNA interference if it can be delivered into the cytoplasm of the target cells. CpG oligodeoxynucleotides can be used for this intracellular transport. CpGs contain DNA motifs similar to those found in bacteria. Innate immune cells can detect this DNA via the toll-like receptor 9 getting activated and stimulated. CpG oligodeoxynucleotides are already in clinical use as adjuvants in vaccines and in cancer therapy approaches. Linking A20-specific siRNA to CpG enables A20 regulation and cell stimulation selectively in toll-like receptor 9 expressing cells, like dendritic cells. Aim of this study was to investigate if these constructs trigger immune cell activation and if they are able to break immune-suppression in the tumor environment to enhance anti-tumor immunity. A long-term growth factor dependent bone marrow-derived dendritic cell culture has been established in order to analyze the CpG-siRNA A20 effects on murine dendritic cells. The constructs were internalized shortly after administration (1 hour) and led to cell stimulation/activation. The intraperitoneal treatment with the constructs induced local cellular activation and systemic IL-6, TNF-α cytokine production in healthy mice. Subcutaneous growing B16 melanoma tumors were treated peritumorally to analyse whether the observed immune-stimulation has effects on established tumors. The silencing of A20 enhances CpG-induced activation of NF-κB followed by elevated expression of IL-6, TNF-α and IL-12 in this tumor model. These changes led to enhanced anti-tumor immune responses manifested by increased numbers of tumor-specific cytotoxic T cells, high levels of tumor cell apoptosis and delayed tumor growth. New constructs were designed and tested on dendritic cells isolated from healthy donors in order to test whether the obtained results for the murine system are applicable to the human system. CpG-siRNA A20 constructs induced cell activation and cytokine expression (IL-6, TNF-α) significantly more than CpG alone. Even though responds of the donor DCs were variable, there are promising similarities to the results of the mouse experiments. The significant role of A20 in controlling the immune-stimulatory activity of DCs has been confirmed in this study. The novel CpG-siRNA A20 constructs provide a strategy for simultaneous A20 silencing and CpG-mediated cell stimulation directly in vivo. This therapeutic approach induces potent adaptive and innate immune responses against established tumors in mouse melanoma model leading to prolongation of survival. CpG-targeted A20 blockade is a new immune-stimulatory approach, which could be suitable for supplementation or optimization of clinical tumor treatments.
  • Krebserkrankungen zählen zu den häufigsten Todesursachen in den westlichen Industrieländern. Heutige Therapieoptionen sind bislang hauptsächlich die operative Entfernung, Bestrahlung und Chemotherapie. Dank intensiver Forschung nehmen alternative Verfahren, wie die Gentherapie und vor allem Immuntherapien stark zu und stellen vielversprechende neue Behandlungsoptionen dar. Der grundlegende Gedanke bei Immuntherapien ist es das körpereigene Immunsystem des Patienten zu unterstützen und zu stimulieren, damit es so in die Lage versetzt wird Tumorzellen eigenständig eliminieren zu können. Ein optimales Ziel dafür sind die Dendritischen Zellen, da sie sehr potente Antigen-präsentierende Zellen sind und im Immunsystem die Weichen stellen in welche Richtung eine Immunantwort verlaufen soll. Eine Stimulation dieser Zellen durch Aktivierung interner Signalwege führt zu ihrer Reifung, zur Hochregulation von Oberflächenrezeptoren sowie zur Sekretion von Zytokinen. Derart manipulierte Dendritische Zellen können zu einer verstärkten Bildung von Effektorzellen und dem Durchbrechen einer Immunsuppression führen. Eine Möglichkeit zur Aktivierung zellulärer Signalwege ist die Blockierung des natürlichen Regulators A20. Zur Herunterregulation der A20 Expression wird in diesem Projekt die Methode der RNA-Interferenz angewendet. Dafür muss eine, gegen A20 gerichtete, siRNA in das Zytoplasma der Zielzellen gelangen. Als Transportsystem wird eine CpG DNA-Sequenz verwendet. Diese CpG-Sequenzmotive sind charakteristische Bausteine von bakterieller DNA und werden daher von Immunzellen als alarmierendes Signal wahrgenommen. Immunzellen, die den Toll-like Rezeptor 9 exprimieren, wie zum Beispiel Dendritische Zellen nehmen diese DNA auf. Infolgedessen kommt es zur Stimulation und Aktivierung dieser Zellen. CpGs werden bereits als immunstimulierende Zusätze bei Impfungen und auch in der Krebstherapie eingesetzt. Die Kopplung einer siRNA zur Blockierung von A20 an CpGs ermöglicht eine selektive Regulation von A20 in Zellen, die den Rezeptor zur CpG-Erkennung besitzen und führt zu ihrer verstärkten Stimulation. Ziel dieses Projekts war es durch den Einsatz von CpG-siRNA A20 Konstrukten gezielt Tumor-assoziierte Immunzellen zu stimulieren, um eine vom Tumor induzierte Immunsuppression zu durchbrechen und eine potente anti-Tumor Immunantwort zu induzieren. Als Modell für die Untersuchung von Internalisation und stimulatorischer Kapazität der CpG-siRNA A20 Konstrukte wurde aus Knochenmarkzellen der Maus eine Langzeitkultur Dendritischer Zellen generiert. Die Konstrukte waren bereits nach einer Stunde in den Zellen nachweisbar und führten zu deutlich verstärkter Zellstimulation im Vergleich zu CpG ohne A20 siRNA. Im Folgenden wurden die Konstrukte auf ihre immunstimulatorische Wirkung bei intraperitonealer Applikation in gesunden Mäusen untersucht. Auch hier konnten deutliche Zeichen der Zellaktivierung detektiert werden. Neben lokalen zellulären Veränderungen im Peritoneum war vor allem die erhöhte Expression der Zytokine IL-6 und TNF-α Anzeichen immunmodulatorischer Effekte. In den darauf folgenden Experimenten wurde das Potential dieser Effekte auf subcutan wachsende Tumore untersucht. In einem Maus-Tumormodell mit Melanomzellen führte die A20 Blockade zu einer Verstärkung der CpG-induzierten Immunstimulation mit deutlich erhöhter Expression der Zytokine IL-6, TNF-α, IFN-γ und IL-12. Infolgedessen konnten signifikant mehr Tumor-spezifische zytotoxische T-Zellen im Blut und im Tumor nachgewiesen werden. Das Wachstum der aggressiven Tumore konnte messbar verlangsamt und dadurch das Überleben der Tiere verlängert werden. Eine Prüfung auf Übertragbarkeit der Ergebnisse von Mäusen auf den Menschen, erfolgte in Dendritischen Zellen isoliert aus dem Blut gesunder Spender. In ersten Versuchen konnte im Vergleich zu CpG eine verstärkte Stimulation der Zellen und eine erhöhte Expression der Zytokine IL-6 und TNF-α nachgewiesen werden. Obwohl die Spenderzellen unterschiedlich stark auf die Behandlung ansprachen, zeigten sich vielversprechende Parallelen zu den Versuchen bei Mäusen. Die gewonnenen Erkenntnisse aus den durchgeführten in vitro und in vivo Experimenten bestätigen die zentrale Rolle von A20 bei der Regulation des immun-stimulatorischen Potentials Dendritischer Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass die neuartigen CpG-siRNA A20 Konstrukte eine gute Möglichkeit zur simultanen A20-Regulation und CpG-basierten Stimulation darstellen. Darüber hinaus konnten mit diesen neuartigen Konstrukten deutliche anti-Tumor Effekte induziert werden, die das Überleben von Mäusen mit aggressiven Melanomen verlängern konnte. Die einfache Applikation eines einzigen synthetischen Moleküls und die starke immunstimulatorische Kapazität machen diese Konstrukte zu einem Immunstimulans mit Zukunftspotential, das die Immuntherapie humaner Tumorerkrankungen ergänzen und verbessern könnte.

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Metadaten
Author: Floriane Braun
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002455-3
Title Additional (German):TLR9-vermittelter A20 Knockdown zur Potenzierung der anti-Tumor Immunantwort
Advisor:Prof. Dr. Christian Andreas Schmidt, Prof. Dr. Barbara Bröker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/03/10
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/02/10
Release Date:2016/03/10
Tag:A20, NF-kappaB Signalweg, TNFAIP3
A20, NF-kappaB pathway, TNFAIP3
GND Keyword:Dendritische Zelle, Immunstimulation, Immuntherapie, Toll-like-Rezeptor, Tumor
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Immunologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit