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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002467-7

Strukturanalysen ausgewählter Proteine des pseudorabies virus

  • Der Replikationszyklus der Herpesviren ist sehr komplex und im Detail unzureichend verstanden. Die Funktionen und Eigenschaften einiger viraler Proteine sind bisher kaum charakterisiert. Folglich gibt es wenige Strukturmodelle dieser Proteine, wodurch beispielsweise eine rationale Medikamentenentwicklung kaum möglich war. Die Zielstellung dieser Arbeit war, neun dieser Proteine (pUL4, -7, -11, -16, -21, -26, -26.5, -32 und -33) aus dem pseudorabies virus (PrV) zu charakterisieren und nach Möglichkeit deren Struktur aufzuklären. Hierzu wurden die zur Verfügung gestellten Gensequenzen in geeignete bakterielle Expressionsvektoren umkloniert und in E. coli exprimiert. Lösliche Proteine wurden gereinigt und anschließend Kristallisationsexperimenten unterzogen, während unlösliche Proteine zum Teil auf ihre Renaturierbarkeit getestet wurden. Die Strukturen des kristallisierten N-terminalen Teils von pUL26 (Assemblin) wurden mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Außerdem wurden alle Proteine in silico auf Signalsequenzen, Phosphorylierungen und Sequenzmuster untersucht. Von der N-terminalen Serinproteasedomäne (Assemblin) von pUL26 wurden drei Strukturen durch Röntgenkristallographie bestimmt: eine native dimere, eine inhibierte dimere, sowie eine native monomere Struktur. Letztere ist das erste bekannte Strukturmodell der monomeren Form eines Assemblins. In Verbindung mit den dimeren Strukturen konnte experimentell bestätigt werden, dass die Aktivierung der Assembline über die Verschiebung eines loop bei der Dimerisierung erfolgt. Die Umlagerung dieses loop basiert darauf, dass sich der in der monomeren Form teilweise flexible Dimerisierungsbereich durch die Dimerisierung etwas verändert und eine weitestgehend starre Konformation einnimmt. Die Helix α8 wird etwas verkürzt und die Helix α7 etwas verlängert und begradigt, wodurch sich der Oxyanionenloch-Loop vom Dimerisierungsbereich entfernt und ein ausgedehntes Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk aufbaut. In dieser Konformation stabilisiert der loop das Oxyanionenloch, wodurch die Protease aktiviert wird. Weiterhin wurde durch small-angle X-ray scattering bestätigt, dass der Dimerisierungsgrad von der Assemblin- und Mg&sup2+;-Ionenkonzentration abhängig ist. Diese Informationen zur Dimerisierung des PrV-Assemblins können dazu beitragen, rationale Medikamentenentwicklung zu betreiben. Daraus resultierende Wirkstoffe können die Dimerisierung und somit die Aktivierung dieses Schlüsselproteins verhindern. Durch die hohe Ähnlichkeit der Assembline in anderen Herpesviren, kann die nun bekannte monomere Struktur des PrV-Assemblins als Modell für die monomere Struktur anderer, zum Teil humanpathogener Herpesviren genutzt werden. Demzufolge könnte dieses Modell auch die Entwicklung von Medikamenten beispielsweise gegen das Epstein-Barr virus oder das herpes simplex virus 1 ermöglichen. Es stellte sich zudem heraus, dass die bisher für das PrV-pUL26 bzw. -pUL26.5 vorhergesagte zweite Assemblinschnittstelle (M-site) vermutlich nicht korrekt ist. Es wurde eine andere M-site vorgeschlagen, welche ebenfalls infrage kommt. Eine Charakterisierung in vitro war bei fünf der neun zu untersuchenden Proteine möglich. Die anderen vier Proteine (pUL7, -16, -21 und -32) konnten aus verschiedenen Gründen nicht erfolgreich exprimiert werden. Die Proteine pUL4, pUL26.5 und pUL33 wurden unlöslich exprimiert, wobei pUL33 renaturiert werden konnte. Der Membrananker pUL11 und die N-terminale Serinproteasedomäne von pUL26 konnten löslich exprimiert werden. Untersuchungen in silico ergaben, dass der Membrananker pUL11 aus dem pseudorabies virus wahrscheinlich ein nukleäres Exportsignal trägt, was bisher nicht bekannt war. Es ist zudem wahrscheinlich, dass pUL11 selbst keine definierte Struktur hat, da es mit 63 Aminosäuren ein sehr kleines Protein ist und über Sequenzmuster mit anderen Proteinen interagiert.
  • The replication cycle of herpesviruses is very complex and insufficiently understood in detail. The functions and properties of some viral proteins are still poorly characterized. Consequently, there are few structural models of these proteins available, which makes rational drug-design hardly possible. The aim of this work was the characterization and — as far as possible — to solve the structures of nine of these proteins (pUL4, -7, -11, -16, -21, -26, -26.5, -32 and -33) from pseudorabies virus (PrV). The available genes were cloned into bacterial expression vectors and expressed in E. coli. Soluble proteins were purified and crystallized, while insoluble proteins were tested for renaturability. The structures of the crystallized N-terminal part of pUL26 (assemblin) were solved by X-ray crystallography. Furthermore, all proteins were checked for signal sequences, phosphorylations and sequence patterns in silico. Three structures of the N-terminal serine-protease domain (assemblin) of pUL26 were solved by X-ray crystallography: a native dimeric, an inhibited dimeric and a native monomeric. The last one is the first known model of a monomeric assemblin. Together with the dimeric structures it could be shown that the activation of assemblins is based on the repositioning of a loop upon dimerization. During dimerization the partly flexible dimerization area is changing and adopts a rather rigid conformation. Helix α8 is slightly shortened and helix α7 is elongated and straightened. This causes the oxyanion-hole loop to be shifted away from the dimerization area and to establish a complex hydrogen-bond network. In this conformation, the loop stabilizes the oxyanion hole and the protease is activated. Small-angle X-ray scattering experiments confirmed that the dimerization depends on the concentrations of assemblin and Mg&sup2+;-ions. Based on these information, rational drug-design at the dimerization area of assemblins should be realizable. Drugs derived from this approach can impede dimerization and thus, activation of this key enzyme of herpesvirus replication. As assemblins of other herpesviruses are similar to the PrV-assemblin, the monomeric structure of this specific assemblin can be used as a model for homologous proteins of human pathogenic herpesviruses. Furthermore, it is likely that the previously proposed M-site of PrV-pUL26 and PrV-pUL26.5 is incorrect. Another M-site is proposed in this work, which is more probable. An in-vitro characterization was possible for five out of the nine proteins. The other four proteins (pUL7, -16, -21 and -32) could not be expressed for different reasons. The proteins pUL4, pUL26.5 and pUL33 were expressed in inclusion bodies, but pUL33 could be renatured. The membrane-associated pUL11 and the N-terminal assemblin domain of pUL26 were expressed as soluble proteins. In silico analyses predict a nuclear export signal in PrV-pUL11, which has not been described earlier. Furthermore, pUL11 is likely to be unstructured as it is a small protein (63 amino acids) and interacts with several other proteins via sequence patterns.

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Metadaten
Author: Martin Zühlsdorf
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002467-7
Title Additional (English):Structural analyses of proteins from pseudorabies virus
Advisor:Prof. Dr. Winfried Hinrichs
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/03/18
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/03/09
Release Date:2016/03/18
Tag:Alphaherpesviren, Alphaherpesvirus, Assemblin, Gerüstprotein, Proteingerüst, Pseudorabies-Virus, Suides Herpesvirus
alphaherpesvirus, assemblin, assembly protein, capsid assembly, pseudorabies virus, scaffold, suid herpesvirus
GND Keyword:Herpesviren, Herpesviridae, Kristallographie, Serinproteasen, Strukturbiologie
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie