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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001821-5

Applying metabolomics to Gram-positive bacteria: Investigations on pathogenic and biotechnological relevant bacteria

  • Metabolomics is the scientific study of metabolites of an organism, cell, or tissue. Metabolomics makes use of different analytical approaches. In this thesis, an analytical platform consisting of proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS, EI/quadrupol) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS, ESI/TOF) was used for metabolite analysis. Due to the high physicochemical diversity of metabolites, the usage of different analytics is profitable. Focusing on metabolome analysis of microorganisms, the development of viable protocols was prerequisite. To ensure metabolome samples of best possible quality, particularly the sampling procedure has to be optimized for each microorganism to be analyzed individually. In microbial metabolomics, the energy charge value is a commonly used parameter to assure high sample quality (Atkinson 1968). The pathogenic bacterium Staphylococcus aureus and the biotechnical relevant bacterium Bacillus subtilis were main target of research. The sampling protocol development “A protocol for the investigation of the intracellular Staphylococcus aureus metabolome” (Meyer et al. 2010) and “Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis”s (Meyer et al. 2013) confirmed the need for development and verification of viable protocols. It was observed, that minor differences in the sampling procedure can cause major differences in sample quality. Using the validated analytical platform and the optimized protocols, we were able to investigate the metabolome of S. aureus and B. subtilis under different conditions. Investigations of the pathogenic bacterium S. aureus are of major interest due to its increasing resistance to antibiotics. Methicillin (multi)-resistant S. aureus (MRSA) strains are responsible for several difficult-to-treat infections. The cell wall of bacteria is the target of an array of antibiotics, like the beta-lactam antibiotics. Our study “A metabolomic view of Staphylococcus aureus and Its Ser/Thr kinase and phosphatase deletion mutants: Involvement in cell wall biosynthesis” (Liebeke et al. 2010) revealed the influence of the serine-threonine kinase on cell wall biosynthesis of S. aureus. LC-MS based metabolome data uncovered prevalent wall teichoic acid precursors in the serine-threonine kinase deletion mutant (ΔpknB), and predominantly peptidoglycan precursors in the phosphatase deletion mutant (Δstp), compared to the S. aureus wild type strain 8325. This uncovered a so far undescribed importance of the serine-threonine kinase on the cell wall metabolism and provides new insights into its regulation. The nasopharynx and the human skin are often the ecological niche of S. aureus. Furthermore, S. aureus exists outside its host, for example on catheters. Depending on its niche, S. aureus is exposed to several stress factors and limitation conditions, such as carbon source limitation and starvation. To cope with the latter, a number of regulatory cellular processes take place. In “Life and death of proteins: a case study of glucose-starved Staphylococcus aureus” (Michalik et al. 2012) protein degradation during glucose starvation was monitored. An intriguing observation was that proteins involved in branch chain amino acid biosynthesis and purine nucleotide biosynthesis were distinctly down-regulated in the clpP mutant. This lead to the assumption of a stronger repression of CodY-dependent genes in the clpP mutant. Intracellular metabolome data revealed higher GTP concentrations in the clpP mutant. This may explain the higher CodY activity and thereby stronger repression of CodY-dependent genes in the clpP mutant. Since different S. aureus strains are known to colonize different niches, global carbon source (glucose, glucose 6-phosphate, glycerol, lactate, lactose and a mixture of all) and carbon source limitation dependent exo-metabolome analyses were performed using three different S. aureus strains (HG001: laboratory strain, EN493: human endocarditis isolate and RF122: bovine mastitis strain). The most apparent observation was that RF122 can utilize lactose best, while EN493 and HG001 are better at utilizing glucose-6-phosphate compared to the bovine RF122 strain. Bacillus subtilis is an extensively studied Gram-positive and non-pathogenic bacterium. In the functional genomics approach “System-wide temporal proteomics profiling in glucose-starved Bacillus subtilis” (Otto et al. 2010) growth phase dependent changes in the proteome, transcriptome and extracellular metabolome were monitored. By mass spectrometric analysis of five different cellular subfractions, ~ 52% of the predicted proteins could be identified. To confirm and complete the proteomic data transcriptome and extracellular metabolome analyses were performed. The extracellular metabolome data ensured that cells were glucose-starved and revealed growth phase dependent metabolic footprints. In “A time resolved metabolomics study: The influence of different carbon sources during growth and starvation of Bacillus subtilis” ((Meyer et al. 2013) submitted) four different compounded cultivation media were investigated as only glucose, glucose and malate, glucose and fumarate and glucose and citrate as carbon source. It could be shown, that B. subtilis is able to maintain an intracellular metabolite homeostasis independent of the available carbon source. On the other hand, in the exo-metabolome, carbon source as well as growth phase dependent differences were detected. Furthermore, in this study the influence of ATP and GTP on the activation of the alternative RNA polymerase sigma factor B (σB) was discussed. The concentration of ATP and GTP decreased for all conditions, as cells entered the stationary growth phase. While cell growth on solely glucose and during growth on glucose and additional malate, the ATP and GTP concentrations increased slightly when the consumption of the second carbon source was initiated. Only under these conditions, a considerable σB activity increase during the transition from exponential to stationary growth phase was observed. Furthermore, the developed sampling protocol for metabolome analysis of B. subtilis enabled us to be part of a “multi omics” system biological approach to study the physiological adjustment of B. subtilis to cope with osmotic stress under chemostat conditions.
  • Die Erforschung des Metaboloms eines Organismus, einer Zelle oder eines Gewebes wird als Metabolomik bezeichnet. In der Metabolomik werden verschiedene analytische Techniken angewandt. In dieser Arbeit wurde eine analytische Plattform, bestehend aus Protonen-Kernresonanzspektroskopie (1H-NMR), Gaschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (GC-MS, EI/Quadrupol) und Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (LC-MS, ESI/TOF) verwendet. Fokussierend auf Metabolomanalysen von Mikroorganismen, war die Entwicklung von geeigneten Probenahmeprotokollen und -strategien Voraussetzung dieser Arbeit. Die Art der Probenahme muss für jeden zu analysierenden Organismus individuell optimiert werden, um eine hohe Probenqualität zu gewährleisten. In Metabolomik-Studien, vor allem im Zuge von mikrobiellen Metabolomuntersuchungen, ist der sogenannte „energy charge“ ein anerkannter Parameter um die Qualität von Proben zu überprüfen (Atkinson 1968). Das pathogene Bakterium Staphylococcus aureus und das biotechnologisch relevante Bakterium Bacillus subtilis waren Forschungsobjekte dieser Arbeit. Die Entwicklung der Probenahmeprotokolle "A protocol for the investigation of the intracellular Staphylococcus aureus metabolome” (Meyer et al. 2010) und “Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis” (Meyer et al. 2013) bestätigt die Notwendigkeit der Entwicklung und Überprüfung geeigneter Protokolle. Es wurde beobachtet, dass geringe Unterschiede im Verlauf der Probengenerierung zu großen Unterschieden in der Qualität der Proben führen können. Durch die Verwendung der validierten analytischen Plattform und der im Detail ausgearbeiteten Protokolle konnte das Metabolom von S. aureus und B. subtilis unter verschiedenen Bedingungen untersucht werden. Physiologische Untersuchungen am pathogenen Bakterium S. aureus sind von großem Interesse. Dieses Interesse ist bedingt durch zunehmende Resistenzen von S. aureus gegen Antibiotika. Angriffspunkt einer Reihe von Antibiotika wie z.B. der Beta-Lactam-Antibiotika, ist die bakterielle Zellwand. In unserer Studie “A metabolomic view of Staphylococcus aureus and Its Ser/Thr kinase and phosphatase deletion mutants: Involvement in cell wall biosynthesis” (Liebeke et al. 2010) wurde der Einfluss der Serin-Threonin-Kinase auf die Zellwand Biosynthese von S. aureus erforscht. LC-MS basierte Metabolomdaten deckten auf, dass im Vergleich zum S. aureus Wildtyp Stamm 8325, Vorstufen der Teichonsäuren vorwiegend in der Serin-Threonin-Kinase-Deletionsmutante (ΔpknB) vorkommen und Peptidoglycan-Vorstufen überwiegend in der Phosphatase-Deletionsmutante (Δstp). Dies zeigt eine bisher nicht beschriebene Bedeutung der Serin-Threonin-Kinase auf den Zellwand-Metabolismus und schafft neue Einblicke in dessen Regulation. Der Nasen-Rachen-Raum und die menschlichen Haut sind häufig die ökologische Nische von S. aureus. Außerdem kann S. aureus außerhalb seines Wirtes wie z.B. auf Kathetern überleben. Je nach Nische, ist S. aureus unterschiedlichen Stressfaktoren und Einschränkungen ausgesetzt, wie z.B. Begrenzungen in der Verfügbarkeit von Kohlenstoffquellen. Um sich diesen unterschiedlichen Bedingungen anzupassen, finden regulatorische zelluläre Prozesse statt. In “Life and death of proteins: a case study of glucose-starved Staphylococcus aureus“ (Michalik et al. 2012) wurde der durch Glukosemangel induzierte Proteinabbau untersucht. Eine auffällige Beobachtung war, dass Proteine, die an der Biosynthese verzweigtkettiger Aminosäuren und der Purin-Nukleotid-Biosynthese beteiligt sind in der clpP Mutante deutlich herab reguliert sind. Dies führte zu der Annahme einer stärkeren CodY-abhängigen Genrepression in der clpP Mutante. Intrazelluläre Metabolomdaten zeigten eine höhere GTP Konzentrationen in der clpP Mutante. Diese könnte die höhere CodY Aktivität und die dadurch stärkere CodY-abhängige Genrepression in der clpP Mutante erklären. Da bekannt ist, dass unterschiedliche S. aureus Stämme verschiedene ökologische Nischen besiedeln, wurden globale extrazelluläre Metabolom-Analysen zu verschiedenen Kohlenstoffquellen (Glukose, Glukose-6-Phosphat, Glycerin, Milchsäure, Laktose und einem Gemisch von allen Vorgenannten) an drei verschiedenen S. aureus Stämmen (HG001: Laborstamm, EN493: menschliches Endokarditis-Isolat und RF122: Rindermastitis-Stamm) durchgeführt. Deutlich wurde insbesondere, dass der Stamm S. aureus RF122 die verfügbare Laktose am besten nutzen konnte, während die Stämme EN493 und HG001 Glukose-6-Phosphat besser aufnehmen konnten als der bovine Stamm. Bacillus subtilis ist ein intensiv untersuchtes Gram-positives und nicht-pathogenes Bakterium. In der Studie “System-wide temporal proteomics profiling in glucose-starved Bacillus subtilis“ (Otto et al. 2010) wurden Wachstumsphasen-abhängig Veränderungen im Proteom, Transkriptom und extrazellulären Metabolom untersucht. Durch massenspektrometrische Analysen von fünf unterschiedlichen zellulären Subfraktionen, konnten ~52% der vorhergesagten Proteine identifiziert werden. Um die Proteomdaten zu bekräftigen und zu vervollständigen, wurden Transkriptom- und extrazelluläre Metabolom-Analysen durchgeführt. Die extrazellulären Metabolomdaten stellten sicher, dass die Zellen Glukose limitiert waren und offenbarten Wachstumsphasen-abhängige extrazelluläre Unterschiede im Metabolom. “A time resolved metabolomics study: The influence of different carbon sources during growth and starvation of Bacillus subtilis“ ((Meyer et al. 2013), submitted) zeigte, dass B. subtilis in der Lage ist, eine, von der verfügbaren Kohlenstoffquelle (Glukose, Glukose und Malat, Glukose und Fumarat, Glukose und Citrat) unabhängige intrazelluläre Metaboliten-Homöostase aufrechtzuerhalten. Auf der anderen Seite wurden Kohlenstoffquellen- sowie Wachstumsphasen-abhängige Unterschiede im extrazellulären Metabolom festgestellt. In dieser Studie wurde außerdem der Einfluss von ATP und GTP auf die Aktivierung des alternativen RNA-Polymerase-Sigma-Faktors B (σB) untersucht. Unter allen untersuchten Bedingungen konnte beim Übergang in die stationäre Wachstumsphase ein Absinken der ATP und GTP Konzentration beobachtet werden. Während des Wachstums auf Glukose allein und beim Wachstum auf Glukose und Malat wurde nach einleiten der Verwertung der zweiten Kohlenstoffquelle ein leichter Anstieg der ATP und GTP Konzentration beobachtet. Ausschließlich unter Letzt genannten Bedingungen wurde beim Übergang aus der exponentiellen Wachstumsphase in die stationäre Wachstumsphase eine σB-Aktivität gemessen. Das entwickelte Probenahmeprotokoll für Metabolomanalyse von B. subtilis ermöglichte darüber hinaus im Rahmen einer "multi-OMICS" Studie zur Systembiologie, die physiologische Anpassung von B. subtilis an osmotischen Stress zu analysieren.

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Metadaten
Author: Hanna Meyer
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001821-5
Title Additional (English):Applying metabolomics to Gram-positive bacteria: Investigations on pathogenic and biotechnological relevant bacteria
Title Additional (German):Anwendung von Metabolom-Untersuchungen an Gram-positiven Bakterien: Untersuchungen von pathogenen und biotechnologisch relevanten Bakterien
Advisor:Prof. Dr. Michael Lalk
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2014/05/14
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/12/16
Release Date:2014/05/14
GND Keyword:Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, metabolomics
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie