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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000701-8

Establishment and application of non-2-D gel-based techniques for identification and quantification of challenging protein classes in Gram-positive bacteria

  • The introduction of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE) enabled the separation and visualization of a substantial fraction of an organism’s entire proteome, and when mass spectrometry entered protein science, these proteins became even amenable to identification on a grand scale. Nevertheless, important classes of proteins elude a separation on classical 2 D gels, as the ones showing extremes in isoelectric point or molecular weight, and foremost very hydrophobic proteins naturally embedded in lipid membranes. This thesis aimed at the establishment and adaptation of alternatives to 2-D PAGE. New techniques allowing for an identification and quantification of critical protein classes were designed and adopted to physiological questions in the Gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. In a comprehensive study on cytoplasmic proteins of S. aureus COL the number of proteins identified by a 2-D gel based approach could be extended by 650 proteins employing gel free technologies. Application of these complementary methods resulted in the establishment of a comprehensive reference map of the cytosolic proteome in growing and non-growing S. aureus cells which can serve as basis for further physiological investigations. Gel free separation of complex protein digests was likewise used in a quantitative study on heat stress in B. subtilis. By implementation of the iTRAQ® technology four different physiological states could be relatively quantified in one experiment. A parallel generation of 2-D gel based data enabled the depiction of strengths and weaknesses of protein quantitation by both, spot intensities on 2-D gels and iTRAQ® signal intensities in MS/MS spectra. Furthermore, new insights into heat sensitivity of pivotal enzymes involved in amino acid biosynthesis could be delivered. The institution of gel free approaches and advancements in 2-D PAGE provide the tools to penetrate into yet unamenable scopes of proteomes. A review on proteome coverage in B. subtilis gives an overview on the strategies which have been explored for most comprehensive protein identification in various sub-proteomes. Although more than one third of B. subtilis’ open reading frames could be demonstrated on protein level, one has to be aware of the fact that it still is a long way to achieve complete coverage of its proteome. Integral membrane proteins make up about one quarter of the entirety of proteins in a cell. Despite their large portion they are clearly understudied due to the intricacy of identification. Their low abundance and non-accessibility of membrane-spanning domains represent major experimental difficulties. The establishment of a protocol efficiently depleting cytosolic proteins by membrane shaving and targeting trans-membrane peptides by novel digestion strategies essentially facilitated identification of highly hydrophobic integral membrane proteins. This protocol was not only successfully applied to the membrane proteome of growing S. aureus cells, but was shown to be applicable in B. subtilis as well. Both studies displayed the novel membrane shaving approach to be highly complementary to a previously established separation of membrane proteins via 1 D PAGE. A combination of the two techniques resulted in identification of about half of the theoretical membrane proteome in both bacteria, and hence layed the foundation for advanced and quantitative analyses. In this regard, 14N/15N metabolically labeled membrane samples of growing and non-growing cells of S. aureus COL were relatively quantified revealing a significant difference in amount for more than one third of the proteins. A corresponding experimental setup was used to compare the membrane proteomes of S. aureus SA113 and its mutant deficient in the lysylphosphatidylglycerol synthetase MprF. Interesting quantitative differences were obtained for proteins most likely involved in the regulation of cellular surface net charge as well as for virulence-associated proteins.
  • Die Einführung der zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese (2D PAGE) ermöglichte es, große Teile des gesamten Proteoms eines Organismus’ in einzelne Proteinspezies aufzutrennen und diese zu visualisieren. Mit dem Einzug der Massenspektrometrie in die Proteinforschung konnten die aufgetrennten Proteine dann sogar im großen Umfang identifiziert werden. Dennoch entziehen sich wichtige Proteinklassen einer Trennung auf dem klassischen 2D Gel. Dazu gehören z. B. Proteine, die Extrema im isoelektrischen Punkt oder Molekulargewicht aufweisen, vor allem aber auch sehr hydrophobe Proteine, die in der Zelle typischerweise in Lipidmembranen eingebettet sind. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anpassung alternativer Methoden zur 2D PAGE. Die in diesem Zusammenhang entwickelten Techniken erlaubten die Identifizierung und Quantifizierung der erwähnten kritischen Proteinklassen und konnten in physiologischen Fragestellungen in den Gram-positiven Bakterien Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus angewendet werden. In einer umfassenden Studie zytoplasmatischer Proteine von S. aureus COL konnte die Zahl der gelbasiert identifizierten Proteine noch um 650 weitere Proteine, die mittels gelfreier Techniken detektiert wurden, ergänzt werden. Durch Anwendung dieser komplementären Ansätze konnte eine umfangreiche Referenzkarte für das cytosolische Proteom von wachsenden und nicht wachsenden S. aureus Zellen erstellt werden, was die Grundlage weiterer physiologischer Untersuchungen darstellt. Eine gelfreie Trennung von komplexen Proben verdauter Proteine wurde auch in einer quantitativen Analyse zum Hitzestress in B. subtilis vorgenommen. Dabei konnten durch den Gebrauch der iTRAQ® Technik in einem Experiment vier unterschiedlich physiologische Zustände gegeneinander quantifiziert werden. Bei paralleler Durchführung von 2D PAGE kristallisierten sich Vor- und Nachteile einer Proteinquantifizierung anhand von Spotvolumina auf 2D Gelen bzw. basierend auf Signalintensitäten von iTRAQ® Reporterionen in MS/MS Spektren heraus. Des Weiteren wurden neue Erkenntnisse über die Hitzesensitivität wichtiger Enzyme der Aminosäurebiosynthese gewonnen. Die Einführung gelfreier Techniken und die Weiterentwicklung der 2D PAGE liefern das Werkzeug, Bereiche des Proteoms zu erfassen, die bis vor Kurzem noch unzugänglich waren. Ein Review über die Abdeckung des Proteoms von B. subtilis gibt einen Überblick über die Strategien, die zu einer möglichst weitreichenden Identifikation der verschiedenen Subproteome verfolgt wurden. Obwohl bereits ein Drittel aller offenen Leserahmen von B. subtilis auf Proteinebene nachgewiesen werden konnten, muss bis zur Verwirklichung einer kompletten Proteomabdeckung noch ein weiter Weg beschritten werden. Integrale Membranproteine repräsentieren etwa ein Viertel aller Proteine einer Zelle. Trotz dieses großen Anteils bleibt die Analyse von Membranproteinen hinter denen anderer Subproteome zurück, was vor allem der Schwierigkeit einer Identifizierung zuzuschreiben ist. Ihre geringe Abundanz und die Unzugänglichkeit membranspannender Domänen stellen hierbei die größten experimentellen Herausforderungen dar. Die Entwicklung eines Protokolls, welches zum einen durch „Abschaben“ von Membranen eine effiziente Abreicherung zytosolischer Proteine erlaubt und zum anderen durch eine neuartige Verdauprozedur transmembrale Peptide detektierbar macht, brachte die Identifizierung von hochhydrophoben, integralen Membranproteinen weit voran. Neben der umfangreichen Identifikation von Membranproteinen vegetativer S. aureus Zellen, konnte das Protokoll auch auf B. subtilis übertragen werden. Beide Arbeiten zeigten, dass die neue Methode hochkomplementär zu der früher etablierten Trennung von Membranproteinen via 1D PAGE ist. Eine Kombination dieser Ansätze führte zur Identifizierung von etwa der Hälfte des theoretischen, integralen Membranproteoms in beiden Organismen und legte die Grundlage für weiterführende und quantitative Studien. In diesem Zusammenhang wurden 14N/15N metabolisch markierte Membranproben von wachsenden und nicht wachsenden Zellen von S. aureus COL relativ quantifiziert, wobei festgestellt wurde, dass bei etwa einem Drittel aller Proteine signifikante Mengenunterschiede vorliegen. Ein vergleichbarer Versuchsaufbau wurde gewählt, um die Membranproteome von S. aureus SA113 und seiner Mutante, der die Lysylphosphatidylglycerol-Synthetase MprF fehlt, zu vergleichen. Dabei konnten interessante quantitative Unterschiede für Proteine, die höchstwahrscheinlich eine Rolle bei der Regulation der zellulären Oberflächengesamtladung spielen, sowie für Virulenz-assoziierte Proteine festgestellt werden.

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Metadaten
Author: Susanne Wolff
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000701-8
Title Additional (English):Establishment and application of non-2-D gel-based techniques for identification and quantification of challenging protein classes in Gram-positive bacteria
Title Additional (German):Etablierung und Anwendung nicht-2D-gelbasierter Techniken zur Identifizierung und Quantifizierung kritischer Proteinklassen in Gram-positiven Bakterien
Advisor:Prof. Dr. Michael Hecker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2009/10/29
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2009/07/08
Release Date:2009/10/29
Tag:Bacillus subtilis, Gelfreie Proteinanalytik, Membranproteine, Proteinquantifizierung, Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, gel-free proteomics, membrane proteins, protein quantification
GND Keyword:Heubacillus, Staphylococcus aureus
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie