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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000824-5

Proteindesign einer Phenylalanin-Ammonium-Lyase - Veränderung des Substratspektrums und Untersuchungen zum Mechanismus

  • Zunächst sollte Aktivität der Phenylalanin-Ammonium-Lyase aus Petroselinum crispum (pcPAL) zur nicht-oxidativen Desaminierung des korrespondierenden Alkohols von Phenylalanin, Phenylalaninol generiert werden. Dazu wurden hochdurchsatzfähige Methoden zur Selektion, wie auch zur Durchmusterung von Mutantenbibliotheken etabliert. Es wurde fokussierte, gerichtete Evolution durchgeführt und zwei Mutantenbibliotheken mit Mutationen im Bereich der Bindungsstelle des Substrates erfolglos auf Aktivität durchsucht. Computersimulationen führten zur Annahme, dass Phenylalaninol wahrscheinlich nicht ausreichend im aktiven Zentrum gebunden werden konnte. Aus diesem Grund wurde eine zusätzliche Wasserstoffbrücke durch Verwendung von Tyrosinol als Substrat und der pcPAL-Phe-137-His Mutante eingeführt, welche nach Computersimulationen in der Lage war das Substrat ausreichend zu stabilisieren. Tatsächlich konnte durch die Einführung einer zweiten Wasserstoffbrücke durch rationales Proteindesign erstmals Aktivität gegenüber einem Aminoalkohol generiert werden. Durch Verwendung der Tyrosin-Ammonium-Lyase aus Rhodobacter sphaeroides (rsTAL), dessen Wildtyp bereits ein Histidin an der korrespondierenden Position 137 (His-89 der rsTAL) besitzt, konnte vergleichbare Aktivität gegenüber Tyrosinol erreicht werden. Durch die Analyse der Substratbindung im aktiven Zentrum wurde ein neues Konzept für den Reaktionsmechanismus der aromatischen Aminosäure-Ammonium-Lyasen, basierend auf der Aminosäureposition 484 (pcPAL) entwickelt. Sequenz- und Strukturvergleiche zeigten eine substratabhängige Konservierung der Position 484 (pcPAL). Enzyme mit einer Präferenz für Phenylalanin besaßen stets ein Glutamat, Tyrosin umsetzende Enzyme stets ein Asparagin an der entsprechenden Position. In silico Mutagenesen und Computersimulationen zeigten, dass ein Glutamat an der Position 484 (pcPAL) die Aminogruppe des Substrates bindet, wodurch die prosthetische, elektrophile MIO-Gruppe nur den aromatischen Ring in einer Friedel-Crafts ähnlichen Reaktion angreifen kann. Befand sich ein Asparagin an Position 484 (pcPAL) konnte die MIO Gruppe die Aminogruppe des Substrates erreichen und die nicht-oxidative Desaminierung über den E1cB Mechanismus mit einem MIO-Amino-Addukt durchführen. Somit wurde postuliert, dass die Ammonium-Lyasen und -Mutasen aromatischer Aminosäuren in Abhängigkeit der Aminosäure an Position 484 (pcPAL) entweder den Friedel-Crafts-Mechanismus (mit Glu-484) oder den E1cB Mechanismus (mit Asn-484) katalysieren können. Durch die Verwendung von m-Tyrosin als „Mechanismusindikator“ und Verwendung der Glu-484-Asn-Mutante der pcPAL konnten experimentelle Hinweise erbracht werden, die die Annahmen aus der Computersimulationen unterstützten. Als Grund für die unkonventionelle, bisher einzigartige „mechanistische Promiskuität“ wurde ein unterschiedliches Konzept der Substratstabilisierung in PAL und TAL vermutet. Tyrosin wird durch Wasserstoffbrücken der p-Hydroxylgruppe und der Carboxylgruppe im aktiven Zentrum gebunden, während Phenylalanin keine Möglichkeit bietet, den Phenylring eindeutig zu orientieren. Daher ist ein Glutamat an der Position 484 zur Substratbindung notwendig. Neben der pcPAL wurde die rsTAL zur Desaminierung von Tyrosinol getestet und zeigte ebenfalls pcPAL-ähnliche Aktivitäten. Versuche, durch fokussierte, gerichtete Evolution und rationales Proteindesign aller Aminosäuren der Carboxyl- und Aminobindetasche, eine aktivere Mutante zur Umsetzung von Tyrosinol zu identifizieren, scheiterten. Computersimulationen wiesen auf ein Wasserstoffbrückennetzwerk hin, dessen Störung sich stets durch verminderte oder zerstörte Aktivität äußerte. Somit musste festgestellt werden, dass in der Carboxyl- und Aminobindetasche keine Mutationen erlaubt sind, die Tyrosinol besser im aktiven Zentrum binden könnten. Daher wurden alternative Substrate untersucht. Tyrosinamid konnte ebenfalls langsam durch die pcPAL-Phe-137-His Mutante und die rsTAL desaminiert werden. Die biotechnologisch bedeutenderen Aminierungsreaktionen wurde gegenüber verschiedenen para-substituierten Zimtsäureanaloga untersucht und mit der korrespondierenden Desaminierungsreaktion verglichen. Die pcPAL setzte Phenylalanin in der natürlichen Desaminierungsreaktion 10-fach schneller um als Zimtsäure aminiert werden konnte. p Nitro-Zimtsäure stellte sich aufgrund der elektronischen Effekte des Substituenten als besonders geeignetes Substrat für die Aminierungsreaktion heraus, welches 9-fach schneller durch die pcPAL aminiert wurde als Zimtsäure. Durch fokussierte, gerichtete Evolution konnten drei Mutanten identifiziert werden, die aufgrund geringerer, sterischer Hinderungen bis zu 1,7-fach gesteigerte Aktivität gegenüber p-Nitro-Zimtsäure zeigten. Verglichen mit der natürlichen Desaminierungsreaktion der pcPAL gegenüber Phenlyalanin, konnte die Phe-137-Val Mutante p Nitro Zimtsäure sogar 1,5-fach schneller aminieren. Somit konnte die Aktivität der Aminierungsreaktion, ausgehend vom pcPAL-Wildtyp gegenüber Zimtsäure, um das 15-fache erhöht werden. Die pcPAL-Phe-137-Val Mutante wies geringere Substratinhibierung sowie höhere Aktivitäten gegenüber einigen Substraten auf. In präparativen Biokatalysen wurde die hohe Aktivität und Enantioselektivität (eep ≥ 97%) der Mutante, besonders in der asymmetrischen Aminierung von p-Nitro-Zimtsäure zu p-Nitro-L-Phenylalanin, erfolgreich auf einen größeren Maßstab übertragen.
  • The first task was the change of the substrate specificity of the Phenylalanine-Ammonia-Lyase from Petroselinum crispum (pcPAL) towards the non-oxidative deamination of the corresponding alcohol of phenylalanine, phenylalaninol. High throughput methods were used based on selection and screening. Using focused directed evolution, two mutant libraries were generated around the substrate binding site, without finding a mutant active towards phenylalaninol. Computer simulations showed, that phenylalaninol is not properly bound in the active site. Therefore, an additional H-bond was introduced by using tyrosinol as a substrate and the pcPAL-mutant Phe-137-His. This rational proteindesign generated the first mentioned activity towards an aromatic aminoalkohol. By using the Tyrosine-Ammonia-Lyase from Rhodobacter sphaeroides (rsTAL) similar activity was achieved. By analyzing the substrate binding in the active site, a new concept for the reaction mechanism of aromatic amino acid-ammonia-lyases was developed, based on residue 484 (pcPAL). Sequence and structure alignments showed a substrate depending conservation of position 484 (pcPAL). Enzymes with a preference for phenylalanine always contained a glutamate at this position, while tyrosine converting enzymes always contained an asparagine at the corresponding position. In silico mutagenesis and computer simulations showed that a glutamate always binds the amino group of the substrate which prevents the prosthetic MIO-group attacking the amino group directly by an E¬1cB mechanism and leads to a Friedel-Crafts-like attack on the aromatic ring of the substrate. With an asparagine at position 484 (pcPAL) the MIO-group could reach the amino group directly, leading to an E1cB mechanism. This led to the hypothesis that aromatic amino acid ammonia-lyases and mutases use one of the two mechanisms depending on the amino acid at position 484 (pcPAL). By using m-tyrosine as a mechanistic indicator substrate and the Glu-484-Asn mutant of the pcPAL, experimental results supported the hypothesis of a promiscuitive reaction mechanism. It was assumed that the different reaction mechanism were caused by different concepts of substrate binding. TAL does not need to use the substrate amino group for substrate binding due to the p-hydroxyl group while PAL need to stabilize the substrate by the H-bonds to the amino group. Focused directed evolution and rational protein design failed to increase the activity towards tyrosinol. It was assumed that there is a very sensitive H-bond network in the binding pocket, essential for catalytic activity. Different para-substituted cinnamic acid analogues were tested in the pcPAL catalyzed amination reaction. While phenylalanine was 10-fold faster deaminated by pcPAL than cinnamic acid was amintated, p-nitro-cinnamic acid was faster aminated than the corresponding amino acid deaminated. This was caused by the electronic effects of the substituent, activating the substrate for a nucleophilic attack. Focused directed evolution of Phe-137 identified several mutants with increased activity in the amination reaction. The Phe-137-Val mutant of pcPAL showed 1,7-fold higher activity in the amination reaction of p-nitro-cinnamic acid and decreased substrate inhibition. By preparative biocatalysis the high amination activity of the mutant was confirmed and excellent enantioselectivities (eep >97%) were determined.

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Metadaten
Author: Sebastian Bartsch
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000824-5
Title Additional (English):Proteindesign of a Phenylalanine-Ammonia-Lyase - Change of Substrate Specificity and Investigations about the Mechanism
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/07/30
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/07/27
Release Date:2010/07/30
GND Keyword:Alkanolamine, Gerichtete Evolution, Molekulardesign, Phenylalanin-Ammoniumlyase, Pr, Promiskuität, Reaktionsmechanismus, Tyrosin-Ammonium-Lyase
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology