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Katharina Prüßmann

• Revaskularisierende Maßnahmen wie die perkutane transluminale Angioplastie sowie die Stentimplantation zählen heutzutage zu den Standardtherapieverfahren der koronaren Herzkrankheit. Insbesondere die Einführung der mit proliferationshemmenden Wirkstoffen wie Paclitaxel oder Sirolimus beschichteten drug-eluting stents (DES) konnte die Restenoserate der behandelten Gefäße auf unter 10 % senken. Der Erfolg der kardiovaskulären Intervention ist dabei insbesondere auch von der Freisetzungskinetik der Wirkstoffe aus der Polymerbeschichtung der Stents abhängig. Methoden zur Untersuchung des In vitro-Freisetzungsverhaltens sind jedoch weder im Europäischen noch im US-Amerikanischen Arzneibuch monographiert, meist werden aber offizinelle Methoden wie der Eintauchende Halter oder die Durchflusszelle sowie nicht offizinelle, einfache Shake-Flask-Methoden zur Bestimmung der In vitro-Freisetzung verwendet. Dabei bleiben allerdings Besonderheiten von DES wie die Einbettungsbedingungen in das Gewebe der Gefäßwand oder die Flussbedingungen unberücksichtigt. Mit der Einführung der Gefäßsimulierenden Durchflusszelle (vFTC) mit einem Gewebemodell in Form eines Hydrogels als zweitem Akzeptorkompartiment konnten dagegen Parameter wie der Blutfluss, die Verteilung des Wirkstoffes in die Gefäßwand sowie reine Diffusionsprozesse auf der abluminalen Seite der Stents in vitro simuliert werden. Durch Modifikation des Hydrogels mittels hydrophober Zusätze konnte auch bereits ein Einfluss auf die Freisetzung von Modellarzneistoffen aus schnellfreisetzenden Stents gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, auch für die tatsächlich in DES eingesetzten Arzneistoffe Sirolimus und Paclitaxel Gewebemodelle auf Basis von Hydrogelen zu entwickeln und den Einfluss dieser Gewebemodelle auf die In vitro-Wirkstofffreisetzung in der vFTC zu untersuchen. Dazu wurden zunächst analytische Methoden zur Quantifizierung der beiden Wirkstoffe entwickelt und validiert. Zur Identifizierung eines geeigneten Freisetzungsmediums wurde anschließend die Stabilität der Wirkstoffe in verschiedenen pufferbasierten und ungepufferten Medien sowie unter Zusatz von stabilisierenden Additiva untersucht. Eine mit Butylhydroxytoluol und Brij® L23 stabilisierte 0,9 %-ige Kochsalzlösung wurde dabei als geeignet identifiziert, die Stabilität der beiden Wirkstoffe über einen Freisetzungszeitraum von fünf Tagen zu gewährleisten. Auf Basis vorhergehender Arbeiten wurde für die Entwicklung der Gewebemodelle auf ein 2 %-iges Agarosegel als Grundlage zurückgegriffen. Um die Verteilung der Wirkstoffe in das Gewebemodell zu erhöhen, wurden verschiedene Zusätze wie Lecithin, LiChroprep® RP-18, Lipofundin® MCT/LCT 20 %, mittelkettige Triglyceride und Cholesterol zur Hydrophobisierung beigemischt. Außerdem wurden Elastin und bovines Serumalbumin als Zusätze gewählt, um spezifische Bindungen der Wirkstoffe im Gewebe zu simulieren. Zur Untersuchung der Eignung der entwickelten Hydrogele als Gewebemodell wurde der Verteilungskoeffizient zwischen Hydrogel und Wirkstofflösung ermittelt und mit ex vivo ermittelten Literaturwerten zwischen humanem Aortengewebe und einer Wirkstofflösung verglichen. Zusätze von 10 % Lipofundin®, 0,1 % LiChroprep® + 0,02 % Lecithin sowie 0,1 % Lecithin wurden als geeignet befunden, um die Verteilung von Sirolimus in das Gewebe humaner Aorta mit unterschiedlichem Status zu simulieren und wiesen zudem eine ausreichende Stabilität für Freisetzungsuntersuchungen in der vFTC über einen Zeitraum von fünf Tagen auf. Die Untersuchung des Einflusses dieser drei Gewebemodelle als Hydrogelkompartiment auf die Wirkstofffreisetzung aus DES in der vFTC wurde mit Sirolimus-beschichteten Stents mit Poly-L-Milchsäure als Beschichtungspolymer über 120 h durchgeführt. Zum Vergleich wurde zusätzlich die Wirkstofffreisetzung in einer einfachen Shake-Flask-Methode sowie in der Durchflusszelle ohne Hydrogelkompartiment beziehungsweise mit einem Agarosegel ohne Zusätze bestimmt. Es konnte ein triphasisches Freisetzungsverhalten mit biphasischem, jeweils nach einer Kinetik 1. Ordnung ablaufenden burst release von 30 - 40 % des Wirkstoffes innerhalb der ersten 12 h sowie nachfolgender langsamer Diffusionsphase beobachtet werden. Ein Vergleich der unterschiedlichen Freisetzungs-methoden zeigte eine langsamere Freisetzung unter Verwendung der Durchflusszelle sowie eine weitere Verringerung des in das Medium freigesetzten Wirkstoffanteils durch die Einführung eines zweiten Akzeptorkompartiments in der vFTC. Statistisch signifikante Unterschiede wurden aber vorrangig in der Verteilung des Wirkstoffes zwischen den Kompartimenten gesehen. So führte die Verwendung von 10 % Lipofundin als Zusatz zu einer Erhöhung des Anteils an Sirolimus im Gewebemodell von etwa 1 % auf fast 14 % der Gesamtfreisetzung nach fünf Tagen (p < 0,05). Im Gegensatz zu vorherigen Untersuchungen mit Modellarzneistoffen ist es für den tatsächlich in DES eingesetzten Wirkstoff Sirolimus also gelungen, ein Gewebemodell mit ausreichend hohem Verteilungskoeffizienten zu entwickeln, mit dem signifikante Unterschiede in der Verteilung zwischen den verschiedenen Kompartimenten der vFTC ermittelt werden konnten. In vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus DES mittels der vFTC können somit durch die Verwendung von Gewebemodellen mit einem den In vivo-Bedingungen angepassten Verteilungskoeffizienten für die betreffenden Wirkstoffe eine noch bessere Abschätzung der In vivo-Verteilung eines aus DES freigesetzten Wirkstoffes in die Arterienwand leisten. Auch für biorelevante In vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus anderen Implantaten können die in dieser Arbeit entwickelten Gewebemodelle möglicherweise einen wertvollen Beitrag leisten.
• Revascularisation via percutaneous transluminal coronary angioplasty and stent implantation plays a major role in the current standard therapy of coronary artery disease. The rate of restenosis has been reduced to below 10 % by the introduction of drug-eluting stents releasing antiproliferative drugs such as paclitaxel or sirolimus. Crucial for the success of the cardiovascular intervention are the release kinetics of the active substances. So far, compendial dissolution test setups for drug-eluting stents have not yet been described in either the Ph. Eur. or the USP. In most cases, the compendial reciprocating holder and flow-through cell or non-compendial shake-flask methods are used for the determination of in vitro drug release from drug-eluting stents. However, none of these test setups are able to take the surrounding tissue or the blood flow through the stent into account. Therefore, the vessel-simulating flow-through cell (vFTC), equipped with a hydrogel as a second compartment mimicking the surrounding tissue, has been developed previously. With this test setup, parameters such as blood flow, distribution of the drug into the tissue and drug release via diffusion from the abluminal side of the stent can be simulated in vitro. An influence on the release behaviour of model substance coated stents with fast release profiles has been observed after modification of the hydrogel with hydrophobic additives. Hence, aim of this work was the development of tissue-mimicking hydrogels that could influence the release of the actually used active substances paclitaxel and sirolimus from drug-eluting stents in the vFTC. For this purpose, analytical methods for the quantification of the two substances were developed and validated. A release medium consisting of 0.9 % sodium chloride, Brij® L23 and butylhydroxytoluene was found suitable for stability of the drugs over a period of five days. Tissue models were prepared with 2 % agarose. In order to increase the distribution of the drugs into the tissue models, lecithin, LiChroprep® RP-18, Lipofundin® MCT/LCT 20 %, medium-chain triglycerides and cholesterol were incorporated into the agarose hydrogels. Furthermore, elastin and bovine serum albumin were chosen as additives to simulate specific binding. Partition coefficients of the drugs between the developed tissue models and solutions of the drugs were determined and compared to partition coefficients obtained ex vivo and described in the literature to evaluate the suitability of the tissue models. Addition of either 10 % Lipofundin®, 0.1 % LiChroprep® + 0.02 % lecithin or 0.1 % lecithin was suitable to simulate human aorta with different status. Evaluation of the influence of the developed tissue models on the release of sirolimus from drug-eluting stents in the vFTC was conducted with poly-(L-lactide) coated stents over 120 h. Additionally, release testing was carried out using a shake-flask method and a flow-through cell without tissue model or an agarose hydrogel without additives, respectively. Release profiles suggest a triphasic release comprising a biphasic burst release of 30 - 40 % of the total drug release following first order kinetics in the first 12 h and a slow diffusion phase. Comparison of the release curves obtained in the different test setups yielded slightly decreased dissolution using the flow-through cells, especially with an additional hydrogel compartment. Moreover, statistically significant differences could be found in the distribution of the drug between the three compartments, hydrogel, medium and stent. Addition of 10 % Lipofundin® resulted in an increase of the amount of sirolimus in the tissue model from 1 % to 14 % of the total sirolimus recovery after 5 days (p < 0.05). In contrast to the previously obtained results for model substance coated stents, the developed tissue models for the actually used active substance sirolimus were suitable to influence at least the distribution of the drug between the different compartments. Thus, dissolution testing of drug-eluting stents with the vFTC and tissue models adjusted to the partition coefficient in vivo might contribute to a better understanding of the in vivo distribution of the drug into the tissue.