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Tackling the Regulation of Pneumococcal Fitness and Virulence Factors

  • Streptococcus pneumoniae is a commensal of the human upper respiratory tract and the etiological agent of several life-threatening diseases. This pathogen is the model bacterium for natural competence. Furthermore, the pneumococci played an important role in the identification of DNA as the main molecule involved in bacterial transformation. As a result, studies on the pneumococcal genome provided an initial overview of the genetic potential of this pathogen. The pneumococcus is a highly versatile bacterium possessing a high rate of uptake and recombination of exogenous DNA from neighboring bacteria. As such, a significant diversity in the genome content among the different pneumococcal strains has been reported. The capsular polysaccharide, an important pneumococcal virulence factor, is the best example on the pneumococcal diversity. There are over 98 serotypes characterized to date presenting differences in their capsule (cps) locus. Additional to the cps locus, the pneumococcus also presents 13 genomic islets annotated as regions of diversity (RD) encoded in the auxiliary genome. Remarkably, 8 of the pneumococcal RD studied so far have been associated with virulence. Furthermore, the ongoing sequencing of over 4000 pneumococcal genomes have shed light on the conservation level of well-known pneumococcal virulence factors. Interestingly, important pneumococcal virulence determinants show variations in the gene and protein sequence among the different strains. Prototypes are for example the pneumococcal surface protein C (PspC) and pneumococcal adherence and virulence factor B (PavB). Conversely, gene regulation in S. pneumoniae is carried out by highly conserved and genome- wide distributed transcriptional factors. Overall, the pneumococci interplays with its environment with 4 major regulatory systems: quorum sensing (QS), stand-alone transcriptional regulators, small RNAs (sRNAs) and two-component regulatory systems (TCS). Some of these systems are multifaceted and share more than one feature. Furthermore, there is crosstalk among the different systems, requiring the activation of a signaling cascade to function properly. A comprehensive analysis of the distribution and conservation of pneumococcal virulence factors and TCS was obtained in this study. The results are summarized as a simplified variome in which 25 pneumococcal strains with a complete sequenced genome were analyzed. Interestingly, the genes encoding the glycolytic protein enolase and the toxin pneumolysin were the most conserved virulence determinants. Additionally, the high level of conservation was confirmed for the pneumococcal TCS regulators, especially for WalKR, CiaRH and TCS08. The main focus of this study was on the regulatory functions of pneumococcal TCS. With this in mind, an extensive and detailed systematic review of the 13 pneumococcal TCS and its orphan RR was undertaken. For this purpose, every pneumococcal TCS was analyzed for its reported functional and structural information along with its contribution to the main pathophysiology of the pneumococci. In brief, S. pneumoniae can utilize its TCS for the regulation of important cellular processes and the sensing of detectable signals in the environment. Additionally, the role of TCS in pneumococcal processes and signal sensing can be divided further. In the first place, pneumococcal TCS regulate competence and fratricide, the production of bacteriocins and host-pathogen interaction processes, while the detectable signals include cell-wall perturbations, environmental stress, and nutrients. As a conclusion from this section, it is possible to analyze the pneumococcal TCS in a comprehensive manner. There is a complex network among the different pneumococcal regulators and the TCS play an important role. Moreover, these systems are highly conserved and essential for the proper functioning of the pneumococcus as a pathogen. Following up on pneumococcal TCS, this study focused especially on the TCS08. Interestingly, the pneumococcal TCS08 has been previously associated with the regulation of the cellobiose metabolism. Furthermore, this system has also been reported to regulate the expression of genes encoded in the RD4 (Pilus-1). Remarkably, the pneumococcal TCS08 was shown to be highly homologous to the SaeRS system of Staphylococcus aureus. Initially, mutant strains lacking a single (Δrr08 or Δhk08) or both components (Δtcs08) of the TCS08 were generated in pneumococcal D39 and TIGR4 strains. Transcriptomics and functional assays showed a downregulation of the PI-1 in the absence of the complete tcs08, while PavB presented an upregulation in the Δhk08 knockout. Moreover, an important number of genes coding for intermediary metabolism proteins were also found to be differentially expressed by microarray analysis. As such, the TIGR4Δhk08 strain presented a downregulation for the cellobiose operon (cel). In contrast, an upregulation was reported for the fatty acid biosynthesis (fab) and arginine catabolism (arc) operons. Conversely, a decrease in gene expression was seen in the TIGR4Δrr08 strain for the arc operon. Finally, in vivo murine pneumonia and sepsis models highlighted an involvement of TCS08 in pneumococcal virulence. Remarkably, the different TCS08 mutants presented a strain dependent effect on their virulence severity. The TIGR4Δrr08, and all TCS08 mutants in D39 showed a decrease in virulence in the pneumonia model, with no changes in sepsis. Conversely, the absence of HK08 in TIGR4 presented a highly virulent phenotype in both pneumonia and sepsis models. To sum up, the pneumococcal TCS08 influenced the expression of genes involved in fitness and colonization. Specifically, those coding for the adhesins PavB and PI-1 and fitness proteins from the cel, arc and fab operons. Remarkably, the highest changes in expression were observed in the strains lacking the HK08. Additionally, TCS08 has a strain dependent impact on pneumococcal virulence as showed by murine pneumonia and sepsis models when comparing the effects in D39 and TIGR4.
  • Streptococcus pneumoniae ist ein Kommensale des oberen humanen Respirationstraktes und ein wichtiger Erreger diverser lebensbedrohlicher Erkrankungen. Das Pathogen ist ein Modellorganismus für die natürliche Kompetenz. Desweiteren spielten die Pneumokokken eine wichtige Rolle bei der Identifizierung der DNA als Hauptmolekül der bakteriellen Transformation. Resultierend daraus ergaben Studien am Pneumokokken-Genom einen ersten Überblick über das genetische Potential des Pathogens. S. pneumoniae ist ein enorm vielseitiges Bakterium, welches sich durch eine hohe Aufnahme- und Rekombinationsrate von exogener DNA auszeichnet. Demzufolge wurde eine hohe Diversität im Genom zwischen verschiedenen Pneumokokkenstämmen beschrieben. Das beste Beispiel hierfür ist das Kapselpolysaccharid, ein wichtiger Virulenzfaktor der Pneumokokken. Bisher wurden über 98 verschiedene Serotypen charakterisiert, die signifikante Unterschiede in ihrem Kapsellokus aufweisen. Zusätzlich zum Kapsellokus besitzen Pneumokokken 13 genomische Inseln, annotiert als Regionen der Diversität (RD), welche im variablen Genom codiert sind. Bemerkenswerterweise sind acht dieser untersuchten RD mit der Virulenz des Bakteriums assoziiert. Desweiteren wurde mittels Sequenzierungen von über 4000 Pneumokokken-Genomen die Konservierung bekannter Virulenzfaktoren beschrieben. Interessanterweise weisen wichtige Virulenzderteminanten Variationen innerhalb der Gen- und Proteinsequenz zwischen verschiedenen Stämmen auf. Dies sind zum Beispiel das pneumococcal surface protein C (PspC) und der pneumococcal adherence and virulence factor B (PavB). Im Gegensatz dazu, wird die Genregulation in S. pneumoniae von hoch konservierten und weit verbreiteten Transkriptionsfaktoren ausgeübt. Insgesamt interagieren Pneumokokken mit Hilfe von vier regulatorischen Systemen mit ihrer Umwelt: Quorum sensing (QS), "stand-alone" Transkriptionsregulatoren, kleine RNAs (sRNAs) und Zwei-Komponenten-Regulationssysteme (TCS). Einige dieser Systeme sind sehr komplex und teilen mehr als nur eine Eigenschaft miteinander. Desweiteren besteht eine gegenseitige Beeinflussung zwischen den verschiedenen Systemen, die für ihre Funktionen die Aktivierung einer Signalkaskade benötigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine umfangreiche Analyse über die Verteilung und Konservierung von Pneumokokken-Virulenzfaktoren und der TCS vorgenommen. Die Ergebnisse sind in einem vereinfachten Variom zusammengefasst, in welchem die vollständigen Genome von 25 Stämmen analysiert wurden. Interessanterweise sind die Gene für das Glykolyseprotein Enolase sowie das Toxin Pneumolysin die am höchsten konservierten Virulenzfaktoren. Ebenso konnte ein hohes Maß der Konservierung für die TCS, insbesondere für WalKR, CiaRH und TCS08, bestätigt werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Analyse der regulatorischen Funktionen der TCS von S. pneumoniae. Hierfür wurde eine umfangreiche, detaillierte sowie systematische Übersicht über die 13 verschiedenen TCS und einem zusätzlichen einzelnen Regulator vorgenommen. Zu diesem Zweck wurde jedes einzelne TCS anhand vorhandenenr funktionaler und struktureller Informationen im Zusammenhang mit seinem Beitrag für die Pathophysiologie der Pneumokokken analysiert. S. pneumoniae kann seine TCS für die Regulation von wichtigen zellulären Prozessen sowie zur Detektion von Umgebungssignalen nutzen. Jedoch kann die Funktion der TCS in der Signaldetektion noch weiter unterteilt werden. In erster Linie regulieren die Pneumokokken-TCS die Kompetenz und den sogenannten Brudermord (engl.: fracticide), die Produktion von Bakteriozinen sowie Prozesse der Wirt-Pathogen Interaktionen. Die hierbei detektierten Signale beinhalten Schädigungen in der Zellwand, Umgebungsstress sowie vorhandene Nährstoffe. Zusammenfassend kann man sagen, das ein komplexes Netzwerk zwischen den verschiedenen Regulatoren in Pneumokokken besteht und die TCS dabei eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus sind diese Systeme hoch konserviert und essentiell für Pathogenität von Pneumokokken. Daran anknüpfend konzentrierte sich diese Arbeit insbesondere auf das TCS08. Interessant ist hierbei, dass das TCS08 vor kurzem mit der Regulation des Zellobiosemetabolismus in Verbindung gebracht wurde. Desweiteren wurde beschrieben, dass dieses System auch die Genexpression der RD4 (Pilus-1 oder PI-1) reguliert. Bemerkenswerterweise ist das TCS08 der Pneumokokken homolog zum SaeRS System von Staphylococcus aureus. Zunächst wurden Mutanten, denen der Responseregulator (Δrr08), die Histidinkinase (Δhk08) oder beide Komponenten (Δtcs08) des TCS08 fehlen, in S. pneumoniae D39 und TIGR4 generiert. Transkriptomics und funktionale Assays zeigten hierbei eine Herunterregulierung der PI-1 Expression in Abwesenheit des tcs08, wohingegen PavB in der Δhk08 Mutante hochreguliert war. Darüber hinaus wurden mittels Microarrays meherere wichtige Gene des Intermediärstoffwechsels identifiziert, die deutliche Unterschiede in der Expression aufwiesen. Hierbei zeigte beispielsweise der Stamm TIGR4Δhk08 eine Herrunterregulierung des Zellobiose-Operons (cel). Im Gegensatz dazu wurde eine Hochregulierung der Operons für die Fettsäurebiosynthese und des Arginin-Katabolismus (arc) beobachtet. Dagegen wurde eine verminderte Genexpression im Stamm TIGR4Δrr08 für das arc-Operon festgestellt. Abschliessend verdeutlichten Mausinfektionsmodelle für Pneumonie und Sepsis einen Beitrag des TCS08 in der Virulenz von S. pneumoniae. Erstaunlicherweise wiesen die verschiedenen TCS08 Mutanten einen Stamm-abhängigen Effekt auf das Ausmaß der Virulenz auf. Der TIGR4Δrr08 Stamm und alle TCS08 Mutanten in S. pneumoniae D39 zeigten eine verringerte Virulenz im Pneumonie-Modell, waren jedoch unverändert im Sepsis-Modell. Im Gegensatz dazu führte das Fehlen der HK08 in TIGR4 zu einem Phänotyp mit erhöhter Virulenz im Pneumonie- sowie Sepsis-Modell. Es kann zusammengefasst werden, dass das TCS08 von S. pneumoniae die Expression von Genen, welche an der Fitness und Kolonisierung beteiligt sind, beeinflusst. Erstaunlicherweise waren die größten Veränderungen in den Stämmen mit fehlender HK08 zu beobachten. Zusätzlich hat das TCS08 eine Stamm-abhängige Auswirkung auf die Virulenz von S. pneumoniae, was durch Vergleiche der Stämme D39 und TIGR4 im Mausmodell der Pneumonie und Sepsis aufgezeigt werden konnte.

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Metadaten
Author: Alejandro Gómez Mejia
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-22695
Title Additional (English):Aufklärung der Regulation von Fitness- und Virulenzfaktoren in Streptococcus pneumoniae
Referee:Prof. Dr. Sven Hammerschmidt, Prof. Dr. Jan-Willem Veening, Prof. Dr. Regine Hakenbeck
Advisor:Prof. Dr. Sven Hammerschmidt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2018
Date of first Publication:2018/07/27
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2018/07/26
Release Date:2018/07/27
GND Keyword:Streptococcus pneumoniae, Two component systems, virulence
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Interfakultäres Institut für Genetik und Funktionelle Genomforschung
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 500 Naturwissenschaften