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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-30440

Improved diagnostic metagenomics for virus discovery

  • The advances in high-throughput sequencing technologies have revolutionized the possibilities for pathogen identification in cases of unknown disease origin. Diagnostic metagenomics allows the unbiased and simultaneous detection of almost all nucleic acids in a clinical sample, with the potential to provide pivotal insights into otherwise undeterminable causes of human or animal disease. In this thesis, possibilities, pitfalls and the suitability of Ion Torrent and Illumina sequencing platforms for comprehensive use in diagnostic metagenomics were assessed and optimized procedures developed. Clinical field samples, undiagnosable by standard diagnostics, were taken as real-life examples for the investigations. The results show that cross-contamination due to index swapping and run-to-run-carryover constitute a major issue on Illumina platforms, severely compromising the correct interpretation of results for clinical specimens. In contrast, Ion Torrent platforms did not display any form of cross-contamination, however, the commercial library preparation method is less efficient. Combining the advantages of both platforms, customized Y adapters, facilitating highly efficient library preparation, were developed for Ion Torrent sequencing and applied in further experiments. The obstacles of strongly degraded RNA in formalin-fixed paraffin-embedded samples were identified and the workflow adapted to meet the requirements of smaller fragments. Additionally, it was shown that adequate sampling is a very important step, if not the most important step, in the workflow, as well as subsequent validation of the obtained results in terms of causation. The achievements in this study allow other researchers the application of a sensitive and optimized diagnostic metagenomics workflow. Furthermore, the investigations on the clinical samples resulted in the discovery of a novel respirovirus with putative zoonotic potential, the first description of Borna disease virus 1 in human organ transplant recipients, and the discovery of a very distantly related novel ovine picornavirus. These discoveries build a basis for further research and expand the knowledge regarding new and emerging viruses.
  • Die Möglichkeiten der Identifizierung von Pathogenen in Krankheitsfällen unbekannter Ursache wurden durch den technischen Fortschritt im Bereich der Hochdurchsatz-Sequenzierung enorm erweitert. Die diagnostische Metagenomanalyse ermöglicht mit der Erfassung nahezu aller Nukleinsäuren einer klinischen Probe eine ergebnisoffene Untersuchung und bietet damit zentrale Erkenntnisgewinne in Fällen, die mit etablierter Standard-Diagnostik nicht aufgeklärt werden können. In dieser Arbeit wurden die Möglichkeiten und Schwierigkeiten sowie die Eignung der Sequenzierplattformen Illumina und Ion Torrent im Hinblick auf einen breiten Einsatz der Metagenomanalyse in der Diagnostik untersucht und optimierte Ansätze entwickelt. Für die Untersuchungen wurden echte Feldproben herangezogen, bei denen die Ursache der Erkrankung mit Standard-Diagnostik nicht aufklärbar war. Kreuz-Kontaminationen aufgrund von Index-Austauschen und Verschleppungen zwischen den Läufen stellten bei der getesteten Illumina-Plattform ein bedeutendes Problem dar, wodurch die korrekte Interpretation der Ergebnisse im Hinblick auf das potentielle Pathogen erheblich erschwert wurde. Bei den getesteten Ion Torrent-Plattformen trat diese Art der Kontaminationen nicht auf, allerdings ist die kommerzielle Methode zur Vorbereitung der Sequenz-Bibliothek weniger effizient. Daher wurden individuell zugeschnittene Y-Adapter für Ion Torrent-Sequenzierungen aufwändig entwickelt und in weiteren Versuchen angewandt. Weiterhin wurden Hürden bei der Untersuchung stark degradierter RNA von formalinfixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe identifiziert und der Workflow entsprechend der Anforderungen angepasst. Die Bedeutung einer adäquaten Probennahme als wesentlicher Schritt des Workflows und die Validierung der erhaltenen Ergebnisse im Hinblick auf die Ursache wurden verdeutlicht. Die Ergebnisse dieser Studie ermöglichen die Anwendung eines optimierten, sehr sensitiven und verlässlichen Workflows für die diagnostische Metagenomanalyse. Des Weiteren resultierten die Untersuchungen der klinischen Proben in der Entdeckung eines neuen Respirovirus mit putativem zoonotischen Potential, der ersten Beschreibung des Borna disease virus 1 in humanen Organtransplantat-Empfängern und der Entdeckung eines neuen ovinen Picornavirus, das phylogenetisch sehr weit von bekannten Picornaviren entfernt ist. Damit leisten diese Entdeckungen einen wichtigen Beitrag zur Identifizierung bisher unbekannter Viren und bilden eine Grundlage für weitere Forschungsansätze.

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Metadaten
Author: Leonie Franziska Forth
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-30440
Title Additional (German):Verbesserung der diagnostischen Metagenomanalyse zur Identifikation unbekannter Viren
Referee:PD Dr. Rainer G. Ulrich, Prof. Dr. Andreas Nitsche, Prof. Dr. Martin Pfeffer
Advisor:PD Dr. Rainer G. Ulrich, Prof. Dr. Martin Beer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2019/09/17
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/06/04
Release Date:2019/09/17
Tag:high-throughput sequencing, metagenomics, virus discovery
GND Keyword:Metagenomik, Optimierung, Sequenzanalyse, Tiergesundheit, Virologie
Pagenumber:134
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie