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Ruth Tamara Montero Meza

• The aquaculture industry has been consistently and successfully growing over the years, supplying over 50% of the fish humans consume. A large part of this success is due to the implementation of vaccination, which is by far the most reliable prophylactic method in large-scale fish farming. Nonetheless, although recent fish vaccines have greatly contributed to the development and sustainability of the aquaculture industry, they not always offer sufficient protection to provide acceptable survival rates when infectious diseases outbreaks occur. Therefore, infectious diseases and effective vaccines still constitute major problems for aquaculture. Different practical aspects and biological factors of fish have also contributed to the unsuccessful outcome of fish vaccines. To date, many of the most effective vaccines for fish are injectable, and their formulation includes aluminum or oil emulsion adjuvants. Both facts constitute a major issue for animal welfare due to the stress and side effects they trigger. Great strides have been made in innovative technologies for fish vaccines. However, as of today, they are not available on the market. Thus, improvements in vaccine formulations and delivery routes remain an open topic and leads the to-do list of science with the aquaculture of the future. Vaccination provides immunity against a determined pathogen, and this is inherent to the immune system. Therefore, thorough knowledge about the fish immune system and how it is influenced by internal and external factors will certainly support rational vaccine design. Thereby, the immune responses triggered by a vaccine can be exhaustively characterized, and the formulations improved in case it is needed. Hence, the goal of this PhD thesis, is to provide knowledge to improve fish vaccination, both in its formulation and in its efficacy, aiming to promote the rational design of fish vaccines. Additionally, this work proposes a holistic view of fish, where the physiology and culture conditions of the fish are the starting points for the development and application of vaccines. Thus, concepts and considerations for rational vaccine design specific for fish are presented here. Article I of this thesis offers a comprehensive review on the current situation in Chile, but also worldwide aquaculture and the challenges it must face in the future. Namely, recurrent pathogenic outbreaks and sub-optimal levels of protection due to inefficient vaccination. This article established an open and flexible ground upon which to reflect on how and what to improve in fish vaccines, leading the efforts towards rational vaccine design. In Article II, we investigated whether the current most used vaccination route, intraperitoneal, can be improved by reducing the side effects of adjuvants, replacing them with in the vaccine formulations with Poly-(D,L-lactic-co-glycolic) acid (PLGA) microparticles, that serve simultaneously as vaccine vehicle and adjuvants. Article III summarizes the scientific literature about what is known about the teleost thymus. From this, it became clear how external factors such as photoperiod and seasonality can modulate this primary lymphatic organ, and probably, immune responses. These are essential factors to consider if effective and protective vaccines are needed in species highly influenced by the environment such as fish. As discussed in Article III, fish are poikilotherm animals, highly sensitive to environmental factors like light. In Article IV, we reported for the first time, light generates daily rhythms in cells’ circulation and gene expression, entraining the trout immune response. Therefore, “when” (time of the day) we stimulate fish matters in order to get optimal immune responses. Article V provides valuable knowledge about what happens with fish immune responses, against a bacterial agent, under constant cues like light/dark cycles and temperature. Once again, “when” we stimulate fish (season), influences the fish immune status and therefore, their immune responses. Finally, Article VI reports, for the first time, leukocytes extracted from fins of trout directly respond to a parasitic infection. This article supports the idea that further research must be done on fish mucosal surfaces, since they are key to stimulating/vaccinating fish, as they are a natural entry route for pathogens and modulate the immune responses mounted. Overall, the information provided by these articles is highly relevant for the aquaculture industry. Firstly, because the vaccine platform based on PLGA microparticles is promising for the future of fish vaccination, harmful adjuvants can be avoided, while still providing enhanced stimulation thanks to the timed-released capacity of the particles. Additionally, they offer the possibility to adapt them to in-feed vaccine pellets, which is the ideal delivery route for fish. Secondly, accurate vaccination protocols can be established; vaccination should be done during daytime, and preferably during the morning, where the physiological status of fish provide optimal conditions for induction of an ultimately protective immune response after vaccination. Furthermore, vaccination should be done during warm months, spring, or summertime, as apparently fish have free-run internal clocks that negatively modulate adaptive immune responses during wintertime. In summary, the present thesis provides a novel concept for vaccination of aquacultured species based on new data for rational vaccine design, with optimal application procedures based on the optimal timing (season and daytime), reduced stress by oral application and considerations about improving “first-line defenses” by vaccination via mucosal surfaces of gut or skin.
• Die Aquakulturindustrie ist im Laufe der Jahre stetig und erfolgreich gewachsen und liefert mehr als 50% der Fische für den menschlichen Verzehr. Ein großer Teil dieses Erfolgs ist auf die Einführung von Impfungen zurückzuführen, die bei weitem die zuverlässigste prophylaktische Methode in Aquakulturbetrieben ist. Doch obwohl die neueren Fischimpfstoffe in hohem Maße zur Entwicklung und Nachhaltigkeit der Aquakulturindustrie beigetragen haben, bieten sie nicht immer ausreichenden Schutz, um bei Ausbrüchen von Infektionskrankheiten akzeptable Überlebensraten zu erzielen. Daher stellen Infektionskrankheiten und wirksame Impfstoffe nach wie vor große Probleme für die Aquakultur dar. Verschiedene praktische Aspekte und biologische Faktoren der Fische tragen ebenfalls dazu bei, dass Fischimpfstoffe nicht erfolgreich sind. Bis heute werden viele der wirksamsten Impfstoffe für Fische durch Injektionen appliziert, und ihre Formulierung enthält Aluminium- oder Ölemulsionsadjuvantien. Beides ist aufgrund des Stresses und der Nebenwirkungen, die sie auslösen, ein entscheidendes Problem für den Tierschutz. Bei der Entwicklung innovativer Technologien für Fischimpfstoffe wurden große Fortschritte erzielt, doch sind sie bis heute nicht auf dem Markt erhältlich. Daher bleiben Verbesserungen der Impfstoff-Formulierungen und der Verabreichungswege ein offenes Thema, das auf der To-do-Liste der Wissenschaft für die Aquakultur der Zukunft ganz oben steht. Impfungen bieten Immunität gegen das entsprechende Pathogen. Deshalb werden fundierte Fachkenntnisse über das Immunsystem der Fische und darüber, wie es durch interne und externe Faktoren beeinflusst wird, die rationelle Entwicklung von Impfstoffen sicherlich unterstützen. Dadurch können die durch einen Impfstoff ausgelösten Immunreaktionen umfassend charakterisiert und die Formulierungen im Bedarfsfall verbessert werden. Ziel dieser Doktorarbeit ist es daher, Wissen zur Verbesserung von Fischimpfstoffen zu gewinnen, und zwar sowohl in Bezug auf ihre Formulierung als auch auf ihre Wirksamkeit, um die Entwicklung von rationalem Design für Fischimpfstoffe zu fördern. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit eine ganzheitliche Betrachtungsweise von Fischen vorgeschlagen, bei der die Physiologie und die Haltungsbedingungen der Fische den Ausgangspunkt für die Entwicklung und Anwendung von Impfstoffen bilden. Daher werden hier die Konzepte und Überlegungen für ein rationales Impfstoffdesign speziell für Fische vorgestellt. Artikel I, der den Rahmen dieser Arbeit bildet, gibt einen umfassenden Überblick über die aktuelle Situation der Aquakultur insgesamt und insbesondere in Chile, und die Herausforderungen, denen sie sich in Zukunft stellen muss. Hierbei werden vor allem die Probleme wiederkehrender Infektionskrankheiten in den Aquakulturanlagen betrachtet und Ursachen unzureichender Herdenimmunität durch nicht optimale Impfregimes diskutiert. Diese Problemanalyse ist Grundlage für Überlegungen zur Verbesserung von Fischimpfstoffen durch ein rationales Impfstoffdesign. In Artikel II untersuchten wir, ob der derzeit am häufigsten verwendete Impfweg, die intraperitoneale Verabreichung, durch die Verringerung der Nebenwirkungen von Adjuvantien verbessert werden kann, indem diese in den Impfstoffformulierungen durch Poly-(D,L-lactid-co-Glycolid)-Mikropartikel (PLGA) ersetzt werden, die gleichzeitig als Impfstoffträger und Adjuvans dienen. Artikel III fasst die wissenschaftliche Literatur zum Thymus der Teleostei zusammen. Dabei wurde deutlich, dass äußere Faktoren wie Photoperiode und Saisonalität dieses primäre lymphatische Organ und dadurch wahrscheinlich auch die Immunreaktionen modulieren können. Dies ist ein grundlegender Punkt, wenn wirksame und schützende Impfstoffe für stark von der Umwelt beeinflusste Lebewesen wie Fische benötigt werden. Wie in Artikel III erläutert, sind Fische poikilotherme Tiere, die sehr empfindlich auf Umweltfaktoren wie Licht reagieren. In Artikel IV berichteten wir zum ersten Mal, dass Licht tägliche Rhythmen im Zellkreislauf und in der Genexpression erzeugt, die die Immunreaktion der Forellen beeinflussen. Daher kommt es darauf an, „wann“ (zu welcher Tageszeit) wir die Fische stimulieren, um optimale Immunreaktionen zu erzielen. Artikel V liefert wertvolle Erkenntnisse darüber, was mit der Immunreaktion von Fischen gegen einen bakteriellen Erreger passiert, wenn konstante Faktoren wie Licht-/Dunkelzyklen und Temperatur eine Rolle spielen. Auch hier gilt, dass der „Zeitpunkt“, zu dem wir die Fische stimulieren (Jahreszeit), den Immunstatus der Fische und damit ihre Immunreaktionen beeinflusst. Schließlich wird in Artikel VI zum ersten Mal berichtet, dass Leukozyten, die aus den Flossen von Forellen gewonnen wurden, direkt auf eine parasitäre Infektion reagieren. Dieser Artikel unterstützt die Idee, dass weitere Forschungen über die Schleimhaut von Fischen durchgeführt werden müssen, da sie der Schlüssel zur Stimulierung/Impfung von Fischen sind, denn Schleimhäute sind der natürlichen Eintrittsweg von Krankheitserregern und modulieren die Immunreaktionen. Insgesamt sind die in diesen Artikeln enthaltenen Informationen für die Aquakulturindustrie von großer Bedeutung. Erstens, weil die Impfstoffplattform auf der Grundlage von PLGA-Mikropartikeln für die Zukunft der Fischimpfung vielversprechend ist, da schädliche Adjuvantien vermieden werden könnten und dank der zeitlichen Freisetzung der Partikel dennoch eine verstärkte Stimulierung erzielt wird. Außerdem bieten sie die Möglichkeit, in Impfpellets für die Fütterung verwendet zu werden, was der ideale Applikationsweg für Fische ist. Zweitens könnten genaue Impfprotokolle erstellt werden; die Impfung sollte tagsüber und vorzugsweise morgens erfolgen, da der physiologische Zustand der Fische dann optimale Bedingungen für die Induktion einer schützenden Immunantwort nach der Impfung bietet. Außerdem sollte die Impfung in den warmen Monaten, also im Frühjahr oder Sommer, durchgeführt werden, da Fische offenbar über eine unabhängige innere Uhr verfügen, die die adaptive Immunreaktion im Winter negativ beeinflusst. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Arbeit ein neuartiges Konzept für die Impfung von Tieren in Aquakultur liefert, das auf neuen Daten für ein rationales Impfstoffdesign basiert, mit optimalen Applikationsverfahren auf der Grundlage des optimalen Zeitpunkts (Jahreszeit und Tageszeit), reduziertem Stress durch orale Verabreichung und Überlegungen zur Verbesserung der „ersten Verteidigungslinie“ durch Impfung an den Schleimhäuten von Darm oder Haut.