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Gayatri Jagirdar

• Tafazzin is an acyltransferase with key functions in remodeling of the mitochondrial phospholipid cardiolipin (CL) by exchanging single fatty acids species in CL. Tafazzin-mediated CL remodeling determines the actual CL compositions and has been implicated in mitochondrial morphology and function. Thus, any deficiency of tafazzin leads to altered fatty acid composition of CL which is directly associated with impaired mitochondrial respiration and ATP production. Mutations in the tafazzin encoding gene TAZ, are the cause of the severe X-linked genetic disease, BARTH syndrome (BTHS). Previous work provided first hints on a linkage of CL composition and subsequent limitations in the cellular ATP levels which may contribute to the restriction of growth. However, in C6 cells ATP levels remained unaltered due to compensatory activation of glycolysis. Moreover, it has been demonstrated that the substantial changes in CL composition are similarly resulting from knocking down either cardiolipin synthase (CRLS) or TAZ. This has also been shown in C6 glioma cells. Most notably only the knock down of TAZ, but not that of CRLS, compromised proliferation of C6 glioma cells. Therefore, a CL- independent role of TAZ in regulating cell proliferation is postulated. In this study, any linkage of the lack of tafazzin to cellular proliferation should be investigated in more detail to allow first insight into underlying mechanisms. The results of the current study demonstrate that the tafazzin knockout in C6 glioma cells show changes in global gene expression by applying transcriptome analysis using the- microarray Clarion S rat Affymetrix array. Out of 22,076 total number of genes detected, 1,099 genes were differentially expressed in C6 knockout cells which were either ≥2 and ≥4 fold up or down regulated genes. Furthermore, expression of selected target genes was validated using RT-qPCR. We have hypothesised that the changes in TAZ dependent gene expression is via PPAR transcription factor. According to eukaryotic promoter database (EPD) for selected target genes, exhibited at least one putative binding site for PPARG and PPARA transcription factors. However, pioglitazone and LG100268, synthetic ligands of PPARG and RXR, could not show any effect on changes in gene expression in C6 TAZ cells. Another class of cellular lipids, oxylipins were found to occur in significantly higher amounts in C6 TAZ cells compared to C6 cells which makes them candidates for mediating cellular effects and regulating gene expression via PPARs. A computational tool CiiiDER was used to for the prediction of transcription factor binding site. The transcription factors enriched in TAZ- regulated genes were found to be HOXA5 and PAX2, binding sites of which could be detected in 100 % of TAZ- regulated genes (>2-fold). By applying IPA to the differentially expressed genes we could identify lipid metabolism, and cholesterol superpathway in particular as the most affected pathway in C6 TAZ cells. This pathway consists of 20 genes, of which all (20/20) appeared to be differentially regulated in C6 TAZ cells. Of all the 20 genes, 4 of the differentially expressed genes were selected for further validation by RT-qPCR. By IPA it was possible to identify the upstream regulators that might be responsible for the differential expression of genes in C6 deficient cells. Some of the genes ACACA, HMGCR, FASN, ACSL1, 3 and, 5 identified was decreased by predicted activation and inhibition of the regulators. Further we have analysed the levels of cellular cholesterol content in C6 and C6 TAZ (w/o Δ5 and FL) cells. In C6 cells cholesterol is present more in its free form. C6 TAZ cells have increased amount of cholesterol compared to C6 cells. However, Δ5 and FL expressed C6 TAZ cells showed less amount of cholesterol. Previous work established that knockout of tafazzin in C6 cells showed decreased cell proliferation in the absence of any changes in ATP content. To understand this phenomenon cellular senescence associated β-galactosidase in C6 and C6 TAZ cells was performed. C6 TAZ cells showed increased percentage of β-gal positive cells compared to C6 cells. Moreover, senescent associated secretory phenotype (SASP) represented by e.g. CXCL1, IL6, and IL1α was determined using RT-qPCR. Gene expression of these SASP factors was significantly upregulated in C6 TAZ cells. Several human tafazzin isoforms exists due to alternate splicing. However, whether these isoforms differ in function and in CL remodelling activity or specificity, in particular, is unknown. The purpose of this work was to determine if specific isoforms, such as human isoform lacking exon 5 (Δ5), rat full length tafazzin (FL) and enzymatically dead full length tafazzin (H69L), can restore the wild type phenotype in terms of CL composition, cellular proliferation, and gene expression profile. Therefore, in the second part, it was demonstrated that expression of Δ5 to some extent and rat full length tafazzin can completely restore CL composition, in C6 TAZ cells which is naturally linked to the restoration of mitochondrial respiration. As expected, a comparable restoration of CL composition could not be seen after re-expressing an enzymatically dead full-length rat TAZ, (H69L; TAZ Mut). Furthermore, re-expression of the TAZ Mut largely failed to reverse the alterations in gene expression, in contrast re-expression of the TAZ FL and the Δ5 isoforms reversed gene expression to a larger extent. Moreover, only rat full length TAZ was able to reverse proliferation rate. Surprisingly, the expression of Δ5 in C6 TAZ cells did not promote proliferation of the wild type. Different effects of Δ5 and FL on CL composition and cell proliferation points to the specific and in part non-enzymatic functions of tafazzin isoforms, but this certainly requires further analysis.
• Tafazzin ist eine Acyltransferase, die eine Schlüsselfunktion beim Umbau des mitochondrialen Phospholipids Cardiolipin (CL) wahrnimmt, indem sie einzelne Acylreste im CL austauscht. Der Tafazzin-vermittelte CL-Umbau bestimmt die aktuelle CL-Zusammensetzung und wurde mit der Morphologie und Funktion von Mitochondrien in Verbindung gebracht. Somit führt jeder Mangel an Tafazzin zu einer veränderten Fettsäurezusammensetzung von CL, die direkt mit einer beeinträchtigten mitochondrialen Atmung und ATP-Produktion verbunden ist. Mutationen im für Tafazzin kodierenden Gen TAZ sind die Ursache der schweren X-chromosomalen genetischen Erkrankung, des BARTH-Syndroms (BTHS). Frühere Arbeiten lieferten erste Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen der CL-Zusammensetzung und daraus resultierenden Einschränkungen des zellulären ATP-Spiegels, welcher zur Wachstumseinschränkung beitragen kann. In C6-Zellen blieben die ATP-Spiegel nach Knockout von Tafazzin jedoch aufgrund der kompensatorischen Aktivierung der Glykolyse unverändert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass wesentliche Änderungen in der CL-Zusammensetzung in ähnlicher Weise aus dem Knockdown von entweder Cardiolipin-Synthase (CRLS) oder TAZ resultieren. Dies wurde auch für C6-Gliomzellen gezeigt. Der Knockdown der CRLS hatte im Gegensatz zu dem Knockdown von TAZ keine Auswirkung auf die Proliferation von C6-Zellen. Daher wird eine CL-unabhängige Rolle von TAZ bei der Regulierung der Zellproliferation postuliert. In dieser Studie sollte jeder Zusammenhang zwischen dem Mangel an Tafazzin und der Zellproliferation genauer untersucht werden und erste Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen ermöglicht werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen unter Anwendung einer Transkriptrom-Analyse (Microarray Clarion S Ratten-Affymetrix-Array), dass der Tafazzin-Knockout in C6-Gliomzellen Veränderungen in der globalen Genexpression bewirkt. Von insgesamt 22.076 nachgewiesenen Genen wurden 1.099 Gene in C6-Knockout-Zellen differentiell exprimiert, d.h., sie zeigten eine ≥2- fache Änderung der Transkript-Menge. Die Expression ausgewählter Zielgene konnte mittels RT-qPCR validiert werden. Die anhand der eukaryotischen Promotordatenbank (EPD) erhaltenen Ergebnisse zeigten für die TAZ-regulierten Gene die Anwesenheit mindestens einer mutmaßlichen Bindungsstelle für die Transkriptionsfaktoren PPARG und PPARA. Daher wurde vermutet, dass die Veränderungen in der TAZ-abhängigen Genexpression über PPAR-Transkriptionsfaktoren erfolgen. Pioglitazon und LG100268, synthetische Liganden von PPARG und RXR, konnten jedoch keine Wirkung auf die Genexpression in C6-TAZ-Zellen zeigen. Es wurde festgestellt, dass Oxylipine, eine andere Klasse zellulärer Lipide, in C6-TAZ-Zellen im Vergleich zu C6-Zellen in signifikant höheren Mengen vorkommen, was sie zu Kandidaten für die Vermittlung zellulärer Wirkungen und die Regulierung der Genexpression über PPARs macht. Das Computertool CiiiDER wurde zur Vorhersage der Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in TAZ-regulierten Genen verwendet. In Übereinstimmung mit den experimentellen Daten wurden in den Promotoren der TAZ-regulierten Gene keine PPAR-Bindungsstellen gefunden. Stattdessen wurden mittels CiiDER die Transkriptionsfaktoren HOXA5 und PAX2 als putative Regulatoren der TAZ-regulierten Gene identifiziert. Konsensus Cis-Elemente für die Faktoren waren in TAZ-regulierten Genen angereichert und konnten in 100 % der TAZ-regulierten Gene (>2-fach) nachgewiesen werden Die Ingenuity Pathway Analyse identifizierte den Lipidstoffwechsel und insbesondere den Cholesterinbiosynthese-Superpathway als am stärksten reguliert in C6-TAZ-Zellen. Dieser Weg beinhaltet 20 Gene, von denen alle (20/20) in C6-TAZ-Zellen differentiell reguliert werden. Von allen 20 differentiell exprimierten Genen wurden vier Gene für die weitere Validierung durch RT-qPCR ausgewählt. Durch IPA war es möglich, übergeordnete Regulatoren zu identifizieren, die für die unterschiedliche Expression von Genen in C6-defizienten Zellen verantwortlich sein könnten. Die mRNA-Expression einiger der identifizierten Gene (ACACA, HMGCR, FASN, ACSL1, 3 und 5) wurde durch vorhergesagte Aktivierung und Hemmung der Regulatoren verringert. Weiterhin wurde der zelluläre Cholesteringehalt in C6- und C6-TAZ- (ohne Δ5- und FL-) Zellen analysiert. In C6-Zellen überwiegt Cholesterin in seiner freien Form. C6-TAZ-Zellen haben im Vergleich zu C6-Zellen eine erhöhte Menge an Cholesterin. Δ5- und FL-exprimierende C6-TAZ-Zellen zeigten jedoch eine geringere Menge an Cholesterin. Vorarbeiten zeigten, dass der Knockout von Tafazzin in C6-Zellen eine Verringerung der Zellproliferation bewirkt, ohne dass Änderungen des ATP-Gehalts vorliegen. Um den Beitrag der Seneszenz zu diesem Phänomen zu bestimmen, wurde die mit zellulärer Seneszenz assoziierte β-Galactosidase in C6- und C6-TAZ-Zellen quantifiziert. C6-TAZ-Zellen zeigten im Vergleich zu C6-Zellen einen erhöhten prozentualen Anteil an β-Galactosidase-positiver Zellen. Der Seneszenz-assoziierte sekretorische Phänotyp (SASP), repräsentiert durch Produktion/Sekretion z.B. von CXCL1, IL6 und IL1α, wurde mittels RT-qPCR überprüft. Es wurden erhöhte Mengen an mRNAs für diese Proteine in C6-TAZ-Zellen nachgewiesen Aufgrund von alternativem Spleißen existieren mehrere menschliche Tafazzin-Isoformen. Ob sich diese Isoformen jedoch in ihrer Funktion und insbesondere in der CL-Remodeling-Aktivität oder -Spezifität unterscheiden, ist unbekannt. Innerhalb dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob und inwiefern spezifische Isoformen, die humane Isoform ohne Exon 5 (Δ5), „full lenght“ Ratten-Tafazzin und enzymatisch inaktives Tafazzin (H69L), den Wildtyp-Phänotyp in Bezug auf die zelluläre CL-Zusammensetzung bzw. zelluläre Proliferation und das Genexpressionsprofil wiederherstellen können. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Re-Expression von Δ5 und „full lenght“ Ratten-Tafazzin in C6-TAZ-Zellen die CL-Zusammensetzung des C6-Wildtyps vollständig wiederherstellen kann, was natürlicherweise mit der Wiederherstellung der mitochondrialen Atmung verbunden ist. Wie erwartet, konnte eine vergleichbare Wiederherstellung der CL-Zusammensetzung nach Expression der enzymatisch inaktiven TAZ-Mutante (H69L; TAZ Mut) nicht beobachtet werden. Eine entsprechende Normalisierung der zellulären Proliferation konnte durch Expression des „full lenght“ Ratten Tafazzins in C6-TAZ erreicht werden. Überraschenderweise korrigierte die Expression von Δ5 in C6-TAZ-Zellen nicht die zelluläre Proliferation in Richtung des Wildtyps. Die enzymatisch inaktive Tafazzin-Variante (TAZ Mut) war nach Expression in C6-TAZ-Zellen nicht in der Lage, die Veränderungen in der Genexpression rückgängig zu machen. Im Gegensatz dazu konnte durch Expression der TAZ FL- und der Δ5-Isoformen die TAZ-abhängigen Veränderungen der Genexpression teilweise aufgehoben werden, allerdings in unterschiedlichem Ausmaß. Dies weist auf die spezifischen und zum Teil nicht-enzymatischen Funktionen von Tafazzin-Isoformen hin, bedarf aber sicherlich weiterer Analysen.