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Lisa Marie Wendt

• Ebolaviruses are dependent on host cell proteins for almost all steps in their viral life cycle. While some cellular factors with crucial roles in the ebolavirus life cycle have been identified, many of them remain to be identified or fully characterised. This thesis focuses on the characterisation and identification of host cell interactions of the highly pathogenic Ebola virus (EBOV), probing host-virus interaction at various stages of the viral life cycle. Beginning with viral budding, the function of a recently proposed late domain motif within the EBOV matrix protein VP40 was examined using an EBOV transcription and replication-competent virus-like particle (trVLP) system. Although this motif has been suggested to interact with the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT), we could show that this late domain motif does not contribute to EBOV budding. While many host cell proteins have been identified so far that are important for viral budding, only a few proteins are known that are necessary for EBOV RNA synthesis. Thus, to identify host proteins that are involved in viral replication and transcription, we performed a genome-wide siRNA screen in the context of an EBOV minigenome assay. Using this approach, we identified several proteins that appear to be important for viral RNA synthesis or protein expression. Two of the most prominent hits in our screen were CAD (Carbamoyl-phosphate synthetase 2, aspartate transcarbamylase and dihydroorotase) and NXF1 (nuclear RNA export factor 1). CAD catalyses the first three steps in the de novo pyrimidine biosynthesis, while NXF1 is the main nuclear export protein for cellular mRNAs. In subsequent characterisation studies, using a range of life cycle modelling systems as well as molecular analyses, we could demonstrate that the canonical function of CAD during the pyrimidine biosynthesis is necessary for EBOV replication and transcription. In contrast to this, for NXF1 we discovered a so-far unknown function: Again, by applying different life cycle modelling alongside with molecular assays, we provided evidence that the EBOV nucleoprotein recruits NXF1 into inclusion bodies, the site of EBOV RNA synthesis, where it binds viral mRNAs to export them from these structures. Importantly, for both CAD and NXF1 we were able to recapitulate key data in the context of live EBOV infection, confirming their roles in the viral life cycle. Both of these identified host factors are promising targets for antiviral therapies and indeed de novo pyrimidine synthesis is emerging as a possible antiviral target for a number of viruses. Similarly, as we could show NXF1 to be important in the life cycle of the highly pathogenic Junín virus, this raises the possibility that disruption of this interaction may result in broad-spectrum antiviral activity. Moreover, for an increasing number of negative-sense RNA viruses inclusion bodies as site of viral RNA synthesis are described to have a liquid organelle character. Therefore, our findings on NXF1 also provide an intriguing model to explain how negative-sense RNA viruses in general overcome this obstacle and export viral mRNAs from inclusion bodies.
• Wie alle Viren sind auch Ebolaviren für ihre Replikation auf Wirtszellproteine angewiesen. Obwohl einige der zellulären Faktoren, die eine entscheidende Rolle im Replikationszyklus von Ebolaviren spielen, bereits identifiziert wurden, sind viele entweder noch unbekannt oder ihre Funktion im viralen Replikationszyklus ist nicht vollständig charakterisiert. Daher lag der Fokus dieser Arbeit auf der Charakterisierung und Identifizierung von Wirtszellinteraktionen des hochpathogenen Ebola-Virus (EBOV), wobei die Virus-Wirtsinteraktionen in verschiedenen Stadien des viralen Replikationszyklus untersucht wurden. Beginnend mit der Assemblierung und Abknospung viraler Partikel wurde die Funktion eines kürzlich vorgeschlagenen late domain-Motivs innerhalb des EBOV Matrixproteins VP40 unter Verwendung eines transkriptions- und replikationskompetenten virusähnlichen Partikelsystems (trVLP) untersucht. Obwohl in vorherigen Studien gezeigt wurde, dass dieses Motiv mit dem für den Transport erforderlichen endosomalen Sortierkomplex (ESCRT) interagiert, konnten wir zeigen, dass es nicht zum EBOV-Abknospungsprozess beiträgt. Auch wenn bereits viele Wirtszellproteine identifiziert wurden, die eine wichtige Rolle für die Assemblierung und Abknospung viraler Partikel spielen, sind nur wenige Proteine bekannt, die für die EBOV RNA Synthese benötigt werden. Um Wirtsproteine zu identifizieren, die an der viralen Replikation und Transkription beteiligt sind, wurde daher eine genomweiter siRNA-Screen im Kontext eines EBOV Minigenomsystems durchgeführt. Mit diesem Ansatz konnten wir mehrere Proteine identifizieren, die für die virale RNA Synthese und/oder Proteinexpression wichtig sind. Zwei der vielversprechendsten Kandidaten in unserem Screen waren CAD (Carbamoylphosphat-Synthetase 2, Aspartat-Transcarbamylase und Dihydroorotase) und NXF1 (nuclear RNA export factor 1). CAD katalysiert die ersten drei Schritte der de novo-Pyrimidinsynthese, während NXF1 das wichtigste nukleäre Exportprotein für zelluläre mRNAs darstellt. In anschließenden Charakterisierungsstudien, bei denen wir eine Reihe von Modellsystemen für den viralen Replikationszyklus sowie molekularbiologischen Analysen verwendeten, konnten wir zeigen, dass die kanonische Funktion von CAD in der Pyrimidin-Biosynthese für die ebolavirale Replikation und Transkription notwendig ist. Im Gegensatz dazu war die von uns identifizierte Funktion von NXF1 noch unbekannt: Durch die Anwendung verschiedener Modellsysteme für den viralen Replikationszyklus zusammen mit molekularbiologischen Analysen konnten wir zeigen, dass das EBOV-Nukleoprotein NXF1 in Einschlusskörperchen rekrutiert, in denen die virale RNA Synthese stattfindet. In diesen Einschlusskörperchen bindet NXF1 virale mRNAs um sie dann aus diesen Strukturen zu exportieren. Des Weiteren konnten wir sowohl für CAD als auch für NXF1 die wichtigsten Daten im Kontext einer EBOV Infektion validieren, was ihre Rolle im viralen Replikationszyklus bestätigt. Beide Wirtsfaktoren sind vielversprechende Ziele für antivirale Therapien und in der Tat zeichnet sich die de novo-Pyrimidinsynthese als mögliches antivirales Ziel für eine Reihe von Viren ab. Da wir zeigen konnten, dass NXF1 auch im Replikationszyklus des hochpathogenen Junín-Virus eine wichtige Rolle spielt, könnte eine Inhibierung der Interaktion mit NXF1 eine Möglichkeit für die Entwicklung eines Breitspektrum-Virostatikum darstellen. Außerdem wird für eine zunehmende Anzahl von Negativ- Strang-RNA Viren beschrieben, dass Einschlusskörper als Ort der viralen RNA Synthese Eigenschaften von liquid organelles aufweisen. Unsere Ergebnisse zu NXF1 könnten daher auch erklären, wie Negativ- Strang-RNA Viren im Allgemeinen die Hindernisse überwinden, die liquid organelles darstellen, und ihre viralen mRNAs aus Einschlusskörpern exportieren.