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Robert Hieronymus

• This thesis summarizes the published works by Robert Hieronymus which were done in the group of bioorganic chemistry of Prof. Dr. Sabine Müller. The different works had the goals to design, develop, and test catalytically active RNA systemes that might have been plausible for an early RNA world scenario. The different RNA systems presented in this thesis were developed via rational design, for which each time the hairpin ribozyme (HPR) was utilized as a design template. The HPR belongs to the group of self-cleaving ribozymes and comes with features that make it a very attractive candidate for the contemplated tasks: It’s small, it’s variable in sequence, and it can cleave or ligate bound RNA substrates depending on the substrate binding strength. Substrates with weak binding to the ribozyme tend to be cleaved while substrates with stronger binding become ligated. This feature was utilized to develop RNA systems with catalytic cascades. The first of the catalytic RNA systems that is presented in this thesis establishes a HPR mediated recombination system. In a one-pot reaction two RNA strands without function but with pro-functional regions are getting bound and cleaved by the HPR in separate ways. The generated fragments with the pro-functional parts are designed to bind stronger to the HPR than their non-functional counterparts and are ligated in a subsequential reaction by the HPR. The recombination product is a hammerhead ribozyme (HHR), and thus, a self-cleaving ribozyme on its own, whose synthesis can be monitored by the addition and cleavage of a separate RNA substrate. The second RNA system is also a recombination system mediated by a HPR, but this time it starts with the functional HHR product from the previous system as an educt. Via a similar mechanism as before the recombination is done with another functional RNA: an RNA aptamer (sensoric RNA). The recombination of HHR and aptamer leads to the generation of a hammerhead aptazyme, an HHR whose cleavage functions are now regulated via ligand binding on the aptamer part. This novel system was successfully demonstrated with RNA sequences of theophylline and FMN aptamers as different educts for the recombination reaction. The HPR in the final work presented here was designed as a self-splicing ribozyme. Here the HPR sequence is located within the intron and is flanked by two exon sequences on both its ends. The developed HPR is able to fold itself in two alternative conformations, both with either one of the intron-exon interfaces located within the formed catalytic site. Subsequently to the first cleavage and dissoziation of one of the exons, the HPR folds into the alternative conformation, which triggers the cleavage reaction of the remaining exon. Once both exons are cleaved off, the fragments are ligated by the HPR, which concludes the catalytic cascade with the healing of the RNA source strand. The various works presented in this thesis demonstrate nicely the flexibility of the HPR and how well suited it is to be utilized as a template in rational design of RNA systems. Furthermore, it is plausible to assume that the HPR, due to its many features, must have had a place in the early RNA world.
• Diese Dissertation fasst die veröffentlichten Arbeiten von Robert Hieronymus zusammen, die im Arbeitskreis Bioogranische Chemie von Prof. Dr. Sabine Müller entstanden sind, mit dem Ziel katalytische RNA-Systeme zu entwickeln und zu testen, die in einem frühen RNA-Weltszenario plausibel erscheinen könnten. Die verschiedenen RNA-Systeme, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, wurden durch rationales Design entworfen. Als Grundlage diente das Hairpin-Ribozym (HPR), aus der Gruppe der selbstspaltenden Ribozyme, welches viele Eigenschaften besitzt, die es zum perfekten Kandidaten macht. So ist es sehr klein, es ist sehr variabel in seiner Sequenz und es kann RNA-Substrate binden und in trans spalten, wobei über die Bindetstärke der Substrate die Richtung der Reaktion gesteuert werden kann. Substrate mit schwacher Bindung zum HPR werden daher vorzugsweise gespalten, wohingegen Substrate mit starker Bindung zur Ligation neigen. Diese Eigenschaft wurde genutzt, um RNA-Systeme mit verschiedenen katalytischen Kaskaden zu bauen. Das erste vorgestellte System etabliert ein HPR-gesteuertes Rekombinationssystem, in dem in einer Eintopfreaktion zwei RNA-Stränge ohne Funktion, aber mit profunktionalen Regionen in separaten Wegen vom HPR gebunden und gespalten werden. Die profunktionalen RNA-Fragemente werden im Anschluss durch das gleiche HPR ligiert. Als Rekombinationsprodukt entsteht ein Hammerhead-Ribozym (HHR) und somit eigenes selbstspaltendes Ribozym, dessen Synthese und Funktionsfähigkeit durch Zugabe und Spaltung eines weiteren RNA-Substrats nachgewiesen werden kann. Beim zweiten RNA-System handelt es sich ebenfalls um ein Rekombinationssystem mit einem HPR im Zentrum, welches das gebildete HHR aus dem ersten System aufnimmt und über einen vergleichbaren Mechanismus mit einer anderen funktionellen RNA, einem RNA-Aptamer (sensorische RNA), rekombiniert, wodurch ein Hammerheadaptazym entsteht dessen Spaltfunktion allosterisch über Ligandenbindung reguliert wird. Dieses System konnte erfolgreich sowohl mit einem Theophyllinaptamer, als auch mit einem FMN-Aptamer als Edukt demonstriert werden. Für das dritte RNA System wurde ein selbstspleißendes HPR entwickelt, bei dem sich die HPR-Sequenz im Intron befindet und an dessen beiden Enden von Exons flankiert ist. Das HPR wurde so konzipiert, dass es zwei alternative Konformationen ausprägen kann, mit jeweils einem der beiden Intro-Exon-Übergänge im katalytischen Zentrum. Nach erster Spaltung und Dissoziation des ersten Exons erfolgt die Umfaltung in die zweite Konformation und die Abspaltung des zweiten Exons. Sobald beide Exons abgespalten sind, endet die katalytische Kaskade mit der anschließenden Ligation der beiden Exonfragmente. Die hier vorgestellten Arbeiten zeigen wunderbar die Flexibilität des HPR auf und wie gut es sich fürs rationale Design eignet. Des Weiteren wird dargelegt, dass das HPR viele verschiedene und wichtige Funktionen in einer frühen RNA-Welt gehabt haben könnte.