Open Access

Anke Karkour

• In den pankreatischen α-Zellen ist Pax6 als Aktivator der Glucagon-Genexpression bekannt, während dessen Einfluss auf die Insulinsynthese kontrovers diskutiert wird. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, wie der Transkriptionsfaktor Pax6 und dessen co-exprimierte Isoform Pax6(5a) in den Insulin-produzierenden β-Zellen agieren, um so auf ihre Funktion in diesen Zellen schließen zu können. Mittels Luciferase-Assays, Northern Blots und Radioimmunoassays wurde gezeigt, dass Pax6 sowohl die Insulinsynthese als und auch die sezernierte Insulinmenge reduzieren kann, wobei die TAAT-Motiv-bindende Homöodomäne als essenziell für diesen Pax6-Effekt identifiziert wurde. Mit Hilfe fluoreszierender Fusionsproteine und der indirekten Immunfluoreszenz konnte beobachtet werden, dass der intrazelluläre Transport von Pax6 Glucose-abhängig erfolgt und zwar gegensätzlich zu dem von PDX-1, einem Aktivator des Insulingens. So befand sich Pax6 bei Glucose-Mangel vor allem im Zellkern, bei hohen Glucose-Konzentrationen hingegen vorwiegend im Cytoplasma. BETA2, das synergistisch mit PDX-1 die Insulin-Genexpression induzieren kann, war Glucose-unabhängig stets im Zellkern lokalisiert. Die physiologische Relevanz der Translokation von Pax6 konnte in vivo durch die immunhistochemische Untersuchung von Pankreasschnitten normo- und hypoglycämischer C57BL/6 Mäuse bestätigt werden. GST-Capture-Assays zeigten die Interaktion von Pax6 und BETA2. Darüber hinaus demonstrierten CHIP-Assays in vivo eine gegensätzliche Glucose-abhängige Bindung von Pax6 und PDX-1 an der ein TAAT-Motiv enthaltenden A3-Box des Ratten Insulin-II-Promotors und unterstützen damit die Hypothese von Pax6 als Inhibitor der Insulin-Genexpression. Das Serin 122 wurde in Pax6 als wichtige regulatorische Aminosäure nachgewiesen, deren Mutation die Glucose-abhängige Translokation und die Wirkung von Pax6 auf den Ratten Insulin-II-Promotor stark beeinflusste. Wahrscheinlich wird diese Aminosäure anders modifiziert, möglicherweise glycosyliert. Eine Glycosylierung des Pax6-Wildtyps bei Glucose-Entzug wurde mittels Immunpräzipitation von EGFP-Pax6 und anschließender Western Blot-Analyse unter Verwendung eines O-GlcNAc-erkennenden RL2-Antikörpers detektiert. So ist zu vermuten, dass bei Glucose-Mangel die Glycosylierung den Transport in den Kern vermittelt und die für den inhibitorischen Effekt von Pax6 auf die Insulin-Genexpression verantwortliche TAAT-bindende Homöodomäne beeinflusst. Für Pax6 lässt sich schlussfolgern, dass es sich bei geringer Glucose-Konzentration im Kern befindet, um die Aktivierung der Insulin-Genexpression zu verhindern, indem es mit BETA2 interagiert und die PDX-1-Bindungsstelle blockiert. Da Pax6 zusätzlich unter diesen Bedingungen auch die Expression der für die β-Zelle spezifischen Gene aktiviert, um sie auf den zukünftigen Bedarf vorzubereiten, ist dessen essenzielle Rolle für die Aufrechterhaltung der β-Zellfunktion unumstritten. Ganz andere Effekte bewirkt hingegen die in den β-Zellen co-exprimierte Isoform Pax6(5a), die durch alternatives Spleißen des Exons 5a entsteht. Ihre Funktion in diesen Zellen war bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sie im Gegensatz zu Pax6 nicht an der Insulingen-Regulation beteiligt ist und auch nicht mit BETA2 interagiert. Analog zu Pax6 wurde ein Glucose-abhängiger Transport innerhalb der Zelle beobachtet. In vitro Kinase-Assays identifizierten in Pax6(5a) Threonin 48 als CKII-Phosphorylierungsstelle. Da es sich hierbei um die erste Aminosäure des Exons 5a handelt, welche somit durch das alternative Spleißen in Pax6 nicht existiert, stellt diese Phosphorylierung eine spezifische Regulation dieser Isoform dar. Mittels fluoreszierender Fusionsproteine war zu beobachten, dass die Imitation dieser Phosphorylierung den Transport von Pax6(5a) in das Cytoplasma verhinderte. Das die CKII zahlreiche für Wachstum und Proliferation verantwortliche Faktoren reguliert, lässt auf die Bedeutung der Pax6(5a)-Isoform in pankreatischen β-Zellen als Regulator des Wachstums für den Erhalt der β-Zellmasse schließen.
• In pancreatic alpha cells Pax6 is known as activator of the glucagon gene expression, while in beta cells its influence on insulin synthesis is discussed controversially. The aim of this work was to investigate the role of the transcription factor Pax6 and its co-expressed isoform Pax6(5a) in insulin-producing beta cells. Luciferase assays, Northern blots and radioimmunoassay showed that Pax6 can repress insulin synthesis and secretion and its TAAT-motif binding homeodomain was identified as essential for this Pax6-effect. Using fluorescent fusion proteins and indirect immunofluorescence it was observed that the intracellular transport of Pax6 and PDX-1, an activator of the insulin gene, is oppositely regulated by glucose. At low concentrations of glucose Pax6 was preferentially localized within the nucleus, whereas under high glucose conditions Pax6 was predominantly detectable in the cytoplasm. BETA2, which synergistically activates the insulin gene expression in conjunction with PDX-1, was always localized in the nucleus independent of glucose. The physiological relevance of this Pax6 translocation was confirmed in vivo by immunohistochemical analyses of pancreas sections of normo- and hypoglycemic C57BL/6 mice. GST capture assays showed the interaction of Pax6 and BETA2. Furthermore, CHIP assays demonstrated in vivo an oppositely regulated glucose-dependent binding of Pax6 and PDX-1 to the TAAT-motif containing A3-box of the rat insulin gene II promoter supporting the hypothesis that Pax6 acts as an inhibitor of insulin gene expression. Serine 122 in Pax6 was identified as important regulatory amino acid, because its mutation strongly influenced the glucose-dependent translocation as well as the effect of Pax6 on the rat insulin gene II promoter. This amino acid is possibly glycosylated. A glycosylation of wildtype-Pax6 under glucose deprivation was detected using immunoprecipitation of EGFP-Pax6 followed by Western blot analysis with an O-Glc-NAc-recognizing RL2-antibody. It can be assumed that the glycosylation mediates the translocation into the nucleus and the influence on the TAAT-motif-binding homeodomain which is responsible for the inhibitory effect of Pax6 on insulin gene expression. From these results it is suggested that at low concentrations of glucose Pax6 is localized in the nucleus and prevents the activation of the insulin gene by occupying the PDX-1 binding site and by interacting with BETA2. Since Pax6 additionally activates the expression of beta-cell specific genes under these conditions, its essential role for the maintenance of the beta cell function is without controversy. Completely different are the effects of the in beta cells co-expressed isoform Pax6(5a) which is generated by alternative splicing. Its function in these cells was unknown so far. In this work it was shown that this isoform is not involved in insulin gene regulation and does not interact with BETA2 in contrast to Pax6. Analogous to Pax6 a glucose-dependent intracellular transport was observed. Using in vitro kinase assays threonine 48 in Pax6(5a) was identified as CKII-phosphorylation site. Since this is the first amino acid within the exon 5a, which is not present in Pax6 through alternative splicing, this phosphorylation is a specific regulation of this isoform. Using fluorescent fusion proteins it was observed that the imitation of this phosphorylation prevented the transport of Pax6(5a) into the cytoplasm. Numerous factors responsible for growth and proliferation are regulated by CKII which suggests a role of the Pax6(5a)-isoform as regulator of growth in pancreatic beta cells to maintain the beta cell mass.