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Anneke Heins

• Primary producers, alongside heterotrophic bacteria and viruses, modulate the essential global carbon cycle. About half of the Earth’s net primary production originates in the marine environment. By effecting these systems and the burial of carbon, bacteria play a significant role in the world’s climate, especially with regard to rising temperatures and increasing anthropogenic carbon dioxide production. Particles present substrate-rich niches for particle-associated bacteria, but are rare in the marine system. Particle-associated bacteria, comprising of chemotactic motile free-living and particle-attached bacteria, were shown to have higher respiration rates, were larger in cell and genome size and showed a higher hydrolytic activity of extracellular enzymes compared to the free-living fraction. Understanding the contribution of particle-associated bacteria to the degradation of algal biomass is essential to understand the marine carbon cycle. However, the identification of this group is difficult and required refinement. Sequential filtration, the most commonly used technique for the separation of bacterial fractions, provides only access to a part of the particle-associated microbiome, and includes with large and clustered bacteria undesired false-positives. To overcome these limitations, separation by gravity in Imhoff sedimentation cones was explored in this thesis to access, identify and define particle-associated microbiomes, in comparison and conjunction with the established separation techniques like sequential filtration and centrifugation. The cultivability on agar plates was assessed, aiming at the question which portion of the colony-forming bacteria belong to free-living non-motile or motile bacteria or to particle-attached bacteria. As continuous cultivation on plates often involves loss of cultures, colonies of the original plate were used to obtain partial 16S rRNA sequences of individual colonies and of plate microbiomes. For future studies on particle-associated bacteria, a representative strain collection was established from particle-attached bacteria retained on 3 μm filters and from particle-associated bacteria collected together with settled algae in sedimentation cones. To understand the contribution of top-down selection to a yearly recurring bacterioplankton bloom at our sampling site Helgoland, particle-associated strains were included in isolation experiments for flavophages, since Flavobacteriia are among the most important responder to the yearly observed blooms. Overall, this thesis provides new insights into the isolation and cultivation of particle-associated bacteria – an important, but currently not fully understood fraction of organisms within the marine system.
• Heterotrophe Bakterien sind maßgeblich an der Remineralisierung mariner Primärproduktion beteiligt und setzen dabei anorganische Nährstoffe frei. Durch die Freisetzung gelösten Kohlenstoffdioxids (CO2) tragen sie zum globalen Kohlenstoffkreislauf bei und nehmen somit Einfluss auf das Weltklima. Schätzungsweise 13 × 10^28 Bakterienzellen leben im Meer und besetzen innerhalb dieses heterogenen Systems unterschiedliche ökologische Nischen. Freilebend nicht-bewegliche Zellen des Bakterioplanktons zeichnen sich durch konstante Wachstums- und Teilungsraten, eine hohe Substrataffinität sowie durch eine geringe Zell- und Genomgröße aus. Sie machen die größte Zahl an Bakterioplanktonzellen im Ozean aus und ernähren sich hauptsächlich von gelöster organischer Materie. Anhaftende Bakterien kolonialisieren partikuläre Materie und nutzen Exoenzyme, um die Partikel innerhalb meist weniger Tage abzubauen. Die dabei freigesetzten gelösten Moleküle werden von chemotaktisch aktiven, beweglichen Bakterien als wegweisender Lockstoff genutzt. Wie die anhaftenden Bakterien zeichnen sich die beweglich freilebenden Bakterien durch eine copiotrophe Überlebensstrategie aus. Sie sind r-Strategen und können unter geeigneten Bedingungen wie zum Beispiel Algenblüten in kurzer Zeit hohe Zellzahlen erreichen, die nachfolgend durch Infektion von Bakteriophagen (Viren, die Bakterien befallen, kurz Phagen) oder dem Fraßdruck von Protisten wieder dezimiert werden. Im letzten Jahrzehnt wurden im Max Planck Institut für marine Mikrobiologie die freilebenden Bakterien während der Algenfrühlingsblüte in der Nordsee bei Helgoland intensiv untersucht. Ein vertieftes Studium der anhaftenden und der chemotaktisch-aktiven Bakteriengruppen, gemeinschaftlich Partikel-assoziierte Bakterien genannt, wurde mit dieser Doktorarbeit aufgenommen. Die Fraktionierung mariner Bakteriengruppen wird überwiegend mittels Größenfiltration vorgenommen. Auf Partikelfiltern verbleiben anhaftende, große und Filament- und Rosetten-bildende Bakterien, wohingegen freilebende Bakterien, bewegliche wie unbewegliche, durch die Filterporen gespült werden. Um Partikel-assoziierte von freilebend-unbeweglichen Bakterien zu unterscheiden, wurde in der ersten Studie eine Gravitations-basierte Separation in Sedimentationsgefäßen genutzt. Die resultierenden Bakterienpopulationen wurden mit anderen Fraktionen verglichen, die entweder durch sequentielle Filtration oder durch Zentrifugation entstanden sind. Zellen wurden gefärbt und gezählt und die erhaltenen Bakteriengemeinschaften wurden mittels Illumina-Sequenzierung bestimmt. Errechnete Anreicherungsfaktoren mit Seewasser als Referenz erlaubten eine Zuordnung einzelner Taxa in fünf diskrete Gruppen, die auf ihre ökologischen Nischen schließen lassen. Lediglich 1% aller Bakterien wachsen auf festen Medien. Es wurde vermutet, dass diese Zellen hauptsächlich der anhaftenden Fraktion zugehörig seien. In der zweiten Studie wurde durch quantitative Bestimmungen von Zellzahlen und Kolonie-bildenden Zellen diese Hypothese experimentell unterstützt. Im Vergleich zur freilebend-unbeweglichen Fraktion haben Partikel-assoziierte Bakterien eine ungefähr zehnfach höhere Kultivierungswahrscheinlichkeit. Filtration, Sedimentation und Zentrifugation wurden für diese Studie als Auftrennungsmethoden genutzt. Die Identifizierung erfolgte auf der Basis individueller Kolonien sowie zum ersten Mal durch eine Analyse der 16S-rRNA-Vielfalt aller Kolonien mit Illumina-Sequenzier-Technologie. In der dritten Studie dieser Arbeit wird die Etablierung einer diversen Stammsammlung von 266 Partikel-assoziierten Bakterienstämmen beschrieben, die für zukünftige Studien genutzt werden kann. Die Stämme wurden von 3-μm-Filtern und der abgesunkenen Bodenfraktion aus Sedimentationsgefäßen isoliert. Zwei dieser Stämme gehören potentiell zu neuen Gattungen und 78 potentiell zu neuen Arten. Eine hohe Übereinstimmung bestand mit einer Stammsammlung, die mit Seewasser als Inokulum aufgebaut worden ist. Dieser Befund spricht für eine Dominanz Partikel-assoziierter Bakterien in der Gruppe Kolonie-bildender Zellen. Bakterienblüten folgen den jährlichen Algenblüten in der Nordsee mit sukzessivem Zellanstieg einiger Genera. Die Zahl der Bakterien im Seewasser kann dabei ein Zehnfaches der vorherigen Zahl erreichen. Flavobacteriia gehören zu den am stärksten reagierenden Bakteriengruppen. Um die Beteiligung von Bakteriophagen an der bakteriellen Zellabnahme zu untersuchen, wurden in der vierten Studie Partikel-assoziierte Stämme der Flavobacteriia zur Phagen-Isolierung eingesetzt. Die Stämme trugen dazu bei, insgesamt 44 neue Phagen in Kultur zu nehmen.