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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002457-2

Proteomics of Bacillus pumilus

  • Members of the species Bacillus pumilus get more and more in focus of the biotechnological industry as potential new production strains. Based on secretome analysis, Bacillus pumilus strain Jo2, possessing high secretion capability, was chosen for an omics based investigation. The physiology of Bacillus pumilus cells growing either in minimal or complex medium was analyzed by a combination of proteomic and metabolomic methods. Master gels of the cytosolic and the secreted proteome covering major parts of the main metabolic pathways were created by means of 2D gel electrophoresis. Quantification of 2D gels allowed displaying the most abundant proteins in these sub-proteomes. Application of the GeLC-MS/MS technique tripled the number of identified proteins and enabled detection of many intrinsic membrane proteins. In total, 1542 proteins were identified in growing B. pumilus cells, among them 1182 cytosolic proteins, 297 membrane and lipoproteins and 63 secreted proteins. This accounts for about 43 % of the 3616 proteins encoded in the B. pumilus Jo2 genome sequence. By using GC-MS, IP-LC/MS and H-NMR methods numerous metabolites were analyzed and assigned to the reconstructed metabolic pathways. Our data indicate that applying a combination of proteomic and metabolomic techniques a comprehensive view of the physiology of growing B. pumilus cells can be gained. In addition, selected production-relevant genome features such as the restriction modification system, NRPS clusters and the secretory system of B. pumilus Jo2 are discussed. In their natural habitat, the soil, B. pumilus cells are often exposed to growth limiting conditions due to the lack of sufficient amounts of nutrients. Such limitations can also occur during fermentation conditions and will negatively influence the efficiency of the process. Glucose is the main carbon and energy source of B. pumilus. Thus, a deficiency of glucose has an enormous impact on cell growth. A 1D LC-MS/MS approach was performed to quantify the proteins using an N14/N15 labeling and to analyze the changes in the protein equipment when B. pumilus cells stop their exponential growth and become stationary due to limitation of glucose. 1033 proteins in the cytosolic fraction of B. pumilus cells were quantified and 272 of them appeared to be upregulated when the cells experience glucose starvation. 2D-PAGE was used to analyze the exoproteome of those cells. Glucose starving B. pumilus cells seemed to focus on usage of proteins and peptides as alternative carbon and energy sources instead of other carbohydrates. Especially the exoproteome of glucose starving cells is dominated by proteases and peptidases. Furthermore, cells used fatty acids as carbon source indicated by upregulation of enzymes involved in β-oxidation and the methylcitrate pathway. Bacillus pumilus is characterized by a higher oxidative stress resistance than other comparable industrially relevant Bacilli such as B. subtilis or B. licheniformis. In this study the response of B. pumilus to oxidative stress was investigated during a treatment with high concentrations of hydrogen peroxide at the proteome, transcriptome and metabolome level. Genes/proteins belonging to regulons, which are known to have important functions in the oxidative stress response of other organisms, were found to be upregulated, such as the Fur, Spx, SOS or CtsR regulon. Strikingly, parts of the fundamental PerR regulon responding to peroxide stress in B. subtilis are not encoded in the B. pumilus genome. Thus, B. pumilus misses the catalase KatA, the DNA-protection protein MrgA or the alkyl hydroperoxide reductase AhpCF. Data of this study suggests that the catalase KatX2 takes over the function of the missing KatA in the oxidative stress response of B. pumilus. The genome-wide expression analysis revealed an induction of bacillithiol (Cys-GlcN-malate, BSH) relevant genes. An analysis of the intracellular metabolites detected high intracellular levels of this protective metabolite, which indicates the importance of bacillithiol in the peroxide stress resistance of B. pumilus. Using the physiological knowledge gained during our studies, we analyzed samples taken during an industrial fermentation process. Five samples were taken during the processes using a protease overexpressing B. pumilus strain and a non-overexpressing B. pumilus reference strain. 2D-PAGE was employed to analyze the samples. 448 proteins could be identified in the samples from the protease overexpressing stain as well as 453 proteins in the reference strain. The proteins were quantified relatively comparing the different growth phases of each strain as well as comparing the strains to each other. The physiological knowledge gained from the shake flask studies enabled us to interpret the findings. Both strains showed an induction of proteins involved in acquisition of alternative carbon sources and of proteins involved in degradation and usage of fatty acids, e.g. the methylcitrate pathway, when they stop exponential growth. This is comparable to the results gained from the analysis of B. pumilus cells under glucose limitation, indicating similar conditions during the processes. Especially in the late phases of the fermentation processes the cells were obviously exposed to severe stress conditions. Our results demonstrated that overexpressing cells showed a significantly stronger oxidative stress response at the end of the fermentation process compared to non-overexpressing cells, which indicated that not only the high cell densities but also the overproduction of the target protein might be responsible for these conditions.
  • In den letzten Jahren gelangten Bacillus pumilis-Stämme als mögliche alternative Produktionsstämme mehr und mehr in den Fokus biotechnologischer Unternehmen. Basierend auf Sekretomanalysen, in denen er hohe Sekretionskapazitäten zeigte, wurde B. pumilus Jo2 für omics-basierte weiterführende Untersuchungen ausgewählt. Mittels einer Kombination aus Proteom- und Metabolomanalyse wurde die Physiologie von in einem Minimalmedium sowie in einem komplexen Medium wachsenden B. pumilus-Zellen analysiert. Mastergele aus 2D-Gelelektrophoresen cytosolischer sowie sekretierte Proteine decken den größten Teil der zentralen Stoffwechselpozesse ab. Ebenso zeigten die 2D-Gele, welche Proteine zu den höchstabuntantesten der jeweiligen Subproteome gehörten. Mittels GeLC-MS/MS konnte die Zahl der identifizierten Proteine verdreifacht und zahlreiche intrinsische Membranproteine identifiziert werden. Insgesamt wurden in wachsenden B. pumilus-Zellen 1542 Proteine identifiziert werden. Darunter waren 1182 cytosolische, 297 Membran- und Lipoproteine sowie 63 sekretierte Proteine. Somit konnten 43% der 3616 im Genom codierten Proteine abgedeckt werden. Mittels GC-MS-, IP-LC/MS- und H-NMR-Techniken wurde eine Vielzahl an Metaboliten identifiziert und den rekonstruierten Stoffwechselprozessen zugeordnet. Zusätzlich wurden einige produktionsrelevandte Features wie das restriktions-Modifikations-System, NRPS-Cluster und das Sekretionssystem im Genom identifiziert und genauer beschrieben. In seinem natürlichen Umfeld im Boden ist B. pumilus oft limitierenden Bedingungen ausgesetzt. Solche Mangelsituationen können auch im Verlauf von industriellen Fermentationsprozessen auftreten und die Enzymproduktion negativ beeinflussen. Glukose ist die bevorzugte C- und Energiequelle für B. pumilus. Daher hat ein Mangel an Glukose einen enormen Einfluss auf die Zellen. Mittels quantitativer 1D LC-MS/MS-Analyse N14/N15-markierter Proteine wurden Veränderungen in der Proteinausstattung von zellen untersucht, die aufgrund von Glukosemangel in die stationäre Phase übergehen. 1033 Proteine wurden dabei im Cytosol von B. pumilus-Zellen quantifiziert. 272 dieser Proteine zeigten unter Glukosemangel eine deutlich gesteigerte Akkumulation. 2D-PAGE wurde genutzt, um das Exoproteom unter diesen Bedingungen zu analysieren. Die Verwertung von Proteinen und Peptiden hat für B. pumilus-Zellen unter Glukoemangel eine besondere Bedeutung. Vor allem im Exoproteom dominierten Proteasen und Peptidasen. Darüber hinaus nutzen die Zellen Fettsäuren als alternative Quellen, was an einer erhöhten Akkumulation von Enzymen der β-Oxidation sowie dem Methylcitrat-Weg zu erkennen war. Es ist bereits beschrieben, dass B. pumilus-Stämme eine deutlich höhere Resistenz gegenüber oxidativen Stress aufweisen als andere industriell relevante Bacilli. In dieser Studie wurde die Reaktion von B. pumilus-Zellen auf eine Behandlung mit eienr hohen Wasserstoffperoxid-Konzentration auf Proteom- sowie auf Transkriptomebene analysiert. Es wurden Gene/Proteine induziert, die in verwandten Bacilli zu Regulons gehören, die bei der oxidativen Stressantwort dieser Organismen wichtige Funktionen erfüllen. Dazu gehören Fur, Spx, SOS oder CtsR. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass Teile des PerR-Regulons aus B. subtilis im Genom von B. pumilus nicht codiert sind. So fehlt im genom die Katalase KatA ebenso wie das DNA-Schutzprotein MrgA oder die Alkylhydroperoxid-Reductase AhpCF. Daten dieser Studie deuten darauf hin, dass die Katalase KatX2 die Funktion der KatA bei der oxidativen Stressantwort von B. pumilus erfüllt. Die genomweite Expressionsanalyse zeigte eine Induktion von bacillithiol-relevandten Genen. Die Analyse der intrazellulären Metabolite stellte eine hohe intrazelluläre Konzentration dieses schützenden Metabolites fest, was darauf hin deutet, dass Bacillithiol an der Peroxid-Stressantwort von B. pumilus beteiligt ist. Basierend auf den bisherigen physiologischen Erkenntnissen wurden Proben aus dem einem industriellen Fermentationsprozess analysiert. Fünf Proben wurden im Verlauf des Prozesses untersucht, sowohl für einen Protease-überexprimierenden Stamm als auch einen nicht-überexprimierenden Referenzstamm. Mittels 2D-PAGE wurden 228 Proteine in überexprimierenden Zellen und 453 Proteine in nicht-überexprimierenden Zellen identifiziert. Diese Proteine wurden relativ quantifiziert und die verschiendenen probenzeitpunkte miteinander verglichen. Die Erfahrungen aus den Schüttelkolben-Versuchen ermöglichten eine Interpretation der Ergebnisse. Beide Stämme zeigten eine Induktion von Proteinen, die an der Verwertung alternativer Kohlenstoff-Quellen beteiligt sind und solcher, die an der Verwertung von Fettsäuren beteiligt sind wie dem Methylcitrat-Weg. das ist vergleichbar mit den Ergebnissen, die bei der Analyse der reaktion auf Glukoselimitation gewonnen wurden und deutet auf ähnliche Bedingungen während der Fermentation hin. Besonders in den späteren Phasen der Prozesse waren die Zellen offensichtlich diversen Stressbedingungen ausgesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass gegen Ende des Prozesses in überexprimierende Zellen eine deultlich stärkere oxidative Stressantwort zu sehen war als in nicht-überexprimierenden Zellen. das deutet darauf hin, dass nicht nur hohe Zelldichten für diese Stresssituation verantwortlich sind, sondern auch die Überexpression eines Proteins einen Einfluss darauf hat.

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Metadaten
Author: Stefan Handtke
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002457-2
Title Additional (English):Proteomics of Bacillus pumilus
Title Additional (German):Proteomics von Bacillus pumilus
Advisor:Prof. Dr. Michael Hecker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/03/10
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/01/12
Release Date:2016/03/10
GND Keyword:Bacillus, Physiologie, Proteomics
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie