• search hit 49 of 184
Back to Result List

Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002477-1

Interaktion genereller Transkriptionsfaktoren mit dem Aktivator Ino2 der Phospholipid-Biosynthese in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

  • In der Hefe S. cerevisiae erfolgt die Transkriptionsregulation der Strukturgene der Phospholipid-Biosynthese in Abhängigkeit der intrazellulären Konzentration der beiden Phospholipid¬vorstufen Inositol und Cholin (IC). Bei IC-Mangel kommt es zu einer Akkumulation des Signalmoleküls Phosphatidsäure, wodurch der Repressor Opi1 extranukleär am endoplasmatischen Retikulum (ER) verankert wird. Dadurch kann der heterodimere Aktivator Ino2/Ino4 an eine spezifische „upstream activation site” (UAS) in der Promotorregion, die als ICRE-Motiv („inositol/choline-responsive element“) bezeichnet wird, binden und die Initiation der Transkription vermitteln. Die aktivierende Wirkung geht dabei von zwei Transkriptions¬aktivierungsdomänen (TAD) im N-Terminus von Ino2 aus. Da bisher unbekannt war, wie die Ino2-vermittelte Genaktivierung erfolgt, bestand das Ziel dieser Arbeit in der Identifizierung der Coaktivatoren, die direkt an die TADs von Ino2 binden. Ferner sollten die für die Transkriptionsaktivierung wichtigen Wechselwirkungen innerhalb der Coaktivatoren präzise kartiert werden. Es konnte hier mit Hilfe der affinitätschromatographischen Methode des GST-„Pulldown“ gezeigt werden, dass TAD1 und TAD2 von Ino2 mit den generellen Transkriptionsfaktoren TFIID und TFIIA interagieren. Innerhalb des TFIID wurden die Untereinheiten Taf1, Taf4, Taf6, Taf10 und Taf12 in vitro als direkte Ino2-Interaktionspartner identifiziert. Dabei binden alle identifizierten Taf-Proteine an die starke TAD1, Taf10 zusätzlich an die TAD2. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass Mutationen innerhalb der TAD1 von Ino2 (D20K, F21R) zu einem vollständigen Verlust der Aktivierungsleistung führen. In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass die gerichtete Mutation dieser Aminosäuren zu einem vollständigen Interaktionsverlust mit den Taf-Proteinen führt. Mit Hilfe von Interaktionsexperimenten wurden innerhalb von Taf1 zwei distinkte Aktivatorinteraktionsdomänen (AID1: AS 1-100; AID2: AS 182-250) kartiert, die die Bindung an Ino2 vermitteln. Mutationen hydrophober und basischer Aminosäure-Reste innerhalb der Taf1-AID2 hatten einen vollständigen Verlust der Interaktion mit Ino2 zur Folge. Möglicherweise sind also ionische und hydrophobe Wechselwirkungen an der Interaktion von Ino2 und Taf1 beteiligt. Mit Hilfe der Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) erfolgte der Nachweis, dass Taf1 in Abhängigkeit von Ino2 auch in vivo an den ICRE-haltigen Promotoren INO1 und CHO2 vorhanden ist. Im Folgenden wurden auch die Ino2-Interaktionsbereiche innerhalb der Proteine Taf6, Taf10 und Taf12 durch die Generierung sukzessiver GST-Verkürzungen eingegrenzt. Taf10 und Taf12 besitzen wie Taf1 zwei separate AIDs (Taf10: AID1 AS 1-100; AID2 AS 131-176; Taf12: AID1 AS 50-100; AID2 AS 100-178). Untersuchungen mit mutagenisierten Varianten, bei denen wie zuvor im Fall von Taf1 hydrophobe und basische Aminosäuren innerhalb der Taf12 AID2 ausgetauscht wurden, führten lediglich zu einer Verringerung der Bindungsintensität. Dies lässt vermuten, dass mehrere kleine Domänen innerhalb der AID2 existieren, die funktionell redundant sind. Mit Hilfe weiterer ChIP-Experimente konnte auch nachgewiesen werden, dass Taf6 und Taf12 abhängig von Ino2 an den untersuchten Promotoren INO1 und CHO2 vorhanden sind. Die Proteine Taf1 und Taf6 wurden exemplarisch für Genexpressionsstudien ausgewählt, um ihren Einfluss auf die Transkription des Gens INO1 unter in vivo Bedingungen nachzuweisen. Durch vergleichende Northernblot-Hybridisierungen mit temperatursensitiven (ts) taf-Mutanten wurde gezeigt, dass die INO1-Expression unter nichtpermissiven Bedingungen (37°C) auf 7% (taf1ts) bzw. 4% (taf6ts) abfällt. Diese Befunde belegen, dass INO1 zu den Taf-abhängigen Genen zählt. Der generelle Transkriptionsfaktor TFIIA wurde ebenfalls auf eine Interaktion mit Ino2 untersucht. Bekannt war bereits, dass der Aktivator Rap1, der ähnlich wie Ino2 mit mehreren TFIID-Untereinheiten interagiert, auch TFIIA kontaktiert. Durch GST-„Pulldown“-Studien konnte die Untereinheit Toa1 als direkter Ino2-Interaktionspartner identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass Toa1 sowohl mit der TAD1 als auch der TAD2 von Ino2 interagiert und die TAD1 Aminosäuresubstitutionen D20K und F21R zu einem vollständigen Interaktionsverlust führen. In dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass die generellen Transkriptionsfaktoren TFIID und TFIIA als Coaktivatoren des für die Transkription der Strukturgene der Phospholipid-Biosynthese essentiellen Aktivators Ino2 fungieren.
  • In the yeast S. cerevisiae, transcription of phospholipid biosynthetic genes is regulated by the intracellular concentration of phospholipid precursors inositol and choline (IC). IC limitation leads to an accumulation of phosphatidic acid and subsequent anchoring of the repressor Opi1 outside the nucleus at the endoplasmic reticulum (ER). A heterodimeric activator consisting of Ino2 and Ino4 now can bind to a specific upstream activation site (UAS) in the promoter region (designated ICRE, “inositol/choline-responsive element) and mediate transcriptional initiation. Activation results from two transcriptional activation domains (TAD) within the N-terminus of Ino2. With IC in excess, Opi1 again passes into the nucleus and binds to the repressor interaction domain (RID) of Ino2, preventing further activation. In addition, Opi1 contacts corepressor complexes Sin3 and Cyc8/Tup1 and their associated histone deacetylases (HDACs), leading to chromatin compaction and repression of the genes affected. Since it was yet unknown how Ino2-dependent genes are activated, this work should identify coactivators which directly bind to TADs of Ino2. In addition, interactions important for transcriptional activation should be mapped precisely within coactivators. Using affinity chromatography (GST-pull down) it could be shown in this work that TAD1 and TAD2 of Ino2 interact with general transcription factors TFIID and TFIIA. TFIID subunits Taf1, Taf4, Taf6, Taf10 and Taf12 could be identified in vitro as direct Ino2 interaction partners. All identified Taf proteins bind to TAD1, Taf10 also interacts with TAD2 while Taf1, Taf4 and Taf10 are also able to contact the basic helix-loop-helix (bHLH) domain which is required for dimerization and DNA binding. Previous work could show that mutations within TAD1 of Ino2 (D20K, F21R) lead to a complete loss of its activation strength. It was demonstrated in this work that directed mutation of these amino acids leads to a complete loss of interaction with Taf proteins. Using interaction experiments based on affinity chromatography, two distinct activator interaction domains (AID1: aa 1-100; AID2: aa 182-250) were mapped within Taf1, mediating the binding to Ino2. Mutating hydrophobic and basic amino acids within AID2 of Taf1 resulted in a complete loss of interaction with Ino2. Possibly, hydrophobic and ionic interactions are involved in the binding of Ino2 to Taf1. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments showed that Taf1 is present at ICRE-containing promoters INO1 and CHO2 even under in vivo conditions, depending on Ino2. Using Taf truncation variants fused to GST, Ino2 interacting regions within proteins Taf6, Taf10 and Taf12 could be mapped more precisely. Similar to Taf1, Taf10 and Taf12 contain two separate AIDs (Taf10: AID1 aa 1-100, AID2 aa 131-176; Taf12: AID1 aa 50-100, AID2 aa 100-178). Experiments using AID2 variants of Taf12 with alterations at the position of hydrophobic and basic amino acids showed only a partial reduction of binding intensity but not a complete loss of interaction. This finding may indicate the existence of several small domains within AID2 which are functionally redundant. Additional ChIP experiments confirmed that Taf6 and Taf12 are also present at promoters INO1 and CHO2, depending on Ino2. To investigate the influence of Taf proteins on transcription of INO1 under in vivo conditions, Taf1 and Taf6 were selected. Comparative Northern blot hybridization experiments using temperature-sensitive (ts) taf mutants demonstrated that expression of INO1 at the non-permissive temperature (37°C) was reduced to 7% (taf1ts) and 4% (taf6ts), respectively. These results support the view that INO1 is a Taf-dependent gene; the same conclusion may be true for additional genes activated by Ino2. TFIIA is known as a general transcription factor, stabilizing TBP-DNA interactions. Thus, subunits of TFIIA were also investigated for interaction with Ino2. It had been described that activator Rap1 which, similar to Ino2, interacts with several subunits of TFIID also binds to TFIIA. Using GST pull down assays, TFIIA subunit Toa1 was identified as a direct interaction partner of Ino2. Toa1 interacts with both TAD1 and TAD2 of Ino2 while interaction is completely abolished with TAD1 missense variants D20K and F21R. To summarize, in this work it could be shown that general transcription factors TFIID and TFIIA function as coactivators of Ino2 which is indispensable for the transcription of phospholipid biosynthetic yeast genes.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Stefan Hintze
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002477-1
Title Additional (English):Interaction of general transcription factors with the activator Ino2 of the phospholipid biosynthesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae
Advisor:Prof. Dr. Hans-Joachim Schüller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/03/31
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/02/03
Release Date:2016/03/31
Tag:Ino2, TFIIA, TFIID
Ino2, Phospholipid biosynthesis, Saccharomyces cerevisiae, TFIIA, TFIID
GND Keyword:Phospholipid-Biosynthese, Saccharomyces cerevisiae, Transkriptionsaktivierung
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie