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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002689-2

Alcohol dehydrogenases as biocatalysts for the production of enantiomerically pure chiral alcohols

  • Summary Enantiomerically pure chiral alcohols are key compounds in the production of certain chemicals including pharmaceuticals. Chemical synthesis allows to obtain maximal yield of 50% for one enantiomer ( >50% yield is achievable with chiral catalysts used in chemical synthesis), whereas biosynthesis leads to nearly 100% yield. Hence, expensive and time consuming resolution of racemic mixture can be avoided. Alcohol dehydrogenases are the most popular enzymes used in the chiral alcohols synthesis due to high activity with appropriate aldehydes or ketones. ADHs require a cofactor which has to be regenerated after the conversion of aldehyde/ketone to the respective alcohol. Thereby, different regeneration methods were used in the practical work to compare and choose the better one. R. erythropolis and C. hydrogenoformans alcohol dehydrogenases were chosen based on the literature screening. Each gene was cloned into Xplor2 vector and pFPMT vector. Xplor2 vector was used for the transformation of A. adeninivorans and pFPMT vector was used for the transformation of H. polymorpha. Chemically synthesized alcohol dehydrogenase sequences from R. erythropolis (ReADH) and C. hydrogenoformans (ChADH) were cloned between TEF1 promoter and PHO5 terminator which are components of Xplor2 vector or between FMD promoter and MOX terminator which are genetic elements of pFPMT vector. Moreover, ChADH and ReADH sequences with His-tag encoding sequence at the 5’ or 3’ end were constructed and the most active form of the protein was selected for further studies. ReADH-6H was used for the synthesis of 1-(S)-phenylethanol and ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate whereas ChADH-6H was used for the production of ethyl (R)-mandelate. ReADH-6H synthesized in A. adeninivorans and H. polymorpha was fully biochemically characterized. The enzymes from the two yeast species showed some differences in their pH and temperature optima, thermostability and activity levels. A-ReADH (A. adeninivorans) and H-ReADH (H. polymorpha) were highly active with the same substrates which were: acetophenone, 4-hydroxy-3-butanone and ethyl 4-chloroacetoacetate for reduction reaction along with 1-phenylethanol and 1,6-hexanediol for oxidation reaction. Recombinant A-ReADH-6H and H-ReADH-6H were synthesized in A. adeninivorans and H. polymorpha, respectively. Both enzymes were used for the synthesis of 1-(S)-phenylethanol and ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate with the use of substrate-coupled cofactor regeneration system. The enantiopurity of the products was >99%. Moreover, A. adeninivorans whole cell catalyst was also used for the synthesis of both chiral alcohols. BmGDH (Bacillus megaterium glucose dehydrogenase) was co-expressed with ReADH-6H for NADH cofactor regeneration. Comparison between isolated enzymes and permeabilized whole cell catalysts indicate that cell biocatalysts are more suitable for the production of 1-(S)-phenylethanol with 92% of acetophenone being converted in 60 min. However, cells did not show any significant advantage over isolated enzymes in the synthesis of ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate although the velocity of the synthesis of ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate was slightly improved using whole-cell catalysts, giving an 80% substrate conversion in 120 min. Recombinant C. hydrogenoformans alcohol dehydrogenase was synthesized in A. adeninivorans and biochemically characterized. Enzyme showed high activity only with one substrate, ethyl benzoylformate. The A. adeninivorans and H. polymorpha cell catalysts synthesizing ChADH and BmGDH (Bacillus megaterium glucose dehydrogenase) were constructed and used in the synthesis of ethyl (R)-mandelate (reduction product of ethyl benzoylformate) with the enantiopurity of the reaction product being >98%. H. polymorpha catalysts were more effective in the synthesis than A. adeninivorans cells. The first were able to convert 93% of ethyl benzoylformate within 180 min and the latter were converting 94% of the substrate within 360 min. Re-use of non-immobilized cells and catalysts entrapped in Lentikat® was performed and the improvement of the stability of immobilized catalysts was reported. Space time yield of 3.07 mmol l-1 h-1 and 6.07 mmol l-1 h-1 was achieved with A. adeninivorans and H. polymorpha cell catalysts, respectively. Alcohol dehydrogenase 1 from A. adeninivorans was analyzed concerning the synthesis of enantiomerically pure chiral alcohols. The enzyme did not synthesize industrially attractive products. However, based on biochemical characterization enzyme plays a role in the synthesis of 1-butanol or ethanol and thereby it is of biotechnological interest.
  • Enantiomerenreine chirale Alkohole sind Schlüsselverbindungen bei der Herstellung von Chemikalien, einschließlich Pharmazeutika. Chemische Synthesen ermöglichen für ein Enantiomer eine maximale Ausbeute von 50% (>50% Ausbeute ist mit chiralen Katalysatoren erreichbar, die in der chemischen Synthese verwendet werden), während die enzymatisch katalysierte Synthese zu annähernd 100% Ausbeute führt. Hierdurch kann eine teure und zeitaufwendige Racemat-Trennung vermieden werden. Alkoholdehydrogenasen (ADHs) sind aufgrund ihrer hohen Aktivität und Stereoselektivität häufig verwendete Enzyme zur Synthese von chiralen Alkoholen durch Reduktion der entsprechenden Aldehyde oder Ketone unter Verbrauch von NADH als Co-Faktor. Die Abhängigkeit vom Co-Faktor erfordert ein geeignetes Regenerationssytem um die Gesamtkosten für den Prozess zu minimieren. In dieser Arbeit wurden verschiedene Regenerationsverfahren genutzt, verglichen und bezüglich ihres Potentials bewertet. Zwei bakterielle Alkoholdehydrogenasen von R. erythropolis und C. hydrogenoformans wurden auf Grund ihrer, bereits in der Literatur beschriebenen, ausgezeichneten Eigenschaften bezüglich der Synthese von chiralen Alkoholen ausgewählt und anschließend in zwei verschiedenen Hefen, A. adeninivorans und H. polymorpha, synthetisiert. Hierfür wurden Codon optimierte Varianten der Gene ReADH und ChADH durch chemische Synthese erzeugt, mit einer His-Tag codierenden Sequenz am 5‘ bzw. 3‘ Ende ausgestattet und in die Expressionsvektoren Xplor2 mit TEF1 Promotor und PHO5-Terminator, sowie pFPMT mit FMD-Promotor und MOX-Terminator kloniert. Nach erfolgter Transformation von A. adeninivorans (Xplor2) bzw. H. polymorpha (pFPMT) wurden die besten Transformanden ausgewählt und für weitere Untersuchungen verwendet. Die Synthese von ReADH-6H wurde sowohl in A. adeninivorans als auch in H. polymorpha untersucht und verglichen. Die jeweils akkumulierten rekombinanten ReADH-6Hs (A-ReADH-6H und H-ReADH-6H) wurden mittels IMAC gereinigt und vollständig biochemisch charakterisiert. Dabei zeigten sich einige Unterschiede in ihren pH- und Temperaturoptima, Thermostabilität und ihrer Aktivität. A-ReADH (A. adeninivorans) und H-ReADH (H. polymorpha) waren hoch aktiv für die Reduktion von Acetophenon, 4-Hydroxy-3-butanon und 4-Chloracetessigsäureethylester als auch für die Oxidationsreaktion von 1-Phenylethanol und 1,6-Hexandiol. A-ReADH-6H und H-ReADH-6H wurden für die Synthese von 1- (S) -Phenylethanol und Ethyl-(R)-4-chlor-3-hydroxybutanoat genutzt, wobei ein substratgekoppeltes Co-Faktorregenerationssystem verwendet wurde. Es konnte eine >99%ige Enantiomerenreinheit der Produkte erreicht werden. Weiterhin wurde A. adeninivorans als Ganzzellkatalysator für die Synthese der beiden chiralen Alkohole verwendet. Dabei wurde BmGDH (Bacillus megaterium Glucosedehydrogenase) mit ReADH-6H co-exprimiert, um den Co-Faktor NADH zu regenerieren. Ein Vergleich zwischen den isolierten Enzymen und den permeabilisierten Ganzzellkatalysatoren zeigte, dass letztere mit 92% umgesetzten Acetophenon in 60 min, besser für die Herstellung von 1-(S)-Phenylethanol geeignet sind. Dies konnte jedoch nicht für die der Synthese von Ethyl-(R)-4-chlor-3-hydroxybutanoat bestätigt werden. Obwohl die Geschwindigkeit der Synthese von Ethyl- (R)-4-chlor-3-hydroxybutanoat durch Ganzzellkatalysatoren leicht erhöht wurde (80% Substratumwandlung in 120 min), konnte keine signifikante Verbesserung gegenüber dem Einsatz von freien Enzymen beobachtet werden. Des Weiteren wurde die C. hydrogenoformans Alkoholdehydrogenase in A. adeninivorans exprimiert und biochemisch charakterisiert. Das Enzym zeigte jedoch nur für das Substrat Ethylbenzoylformiat eine hohe Aktivität. ChADH und BmGDH (Bacillus megaterium Glucosedehydrogenase) co-exprimierende A. adeninivorans und H. polymorpha Zellkatalysatoren wurden generiert und für die Synthese von Ethyl- (R)-mandelat (Reduktionsprodukt von Ethylbenzoylformiat) eingesetzt. Die Enantiomerenreinheit des Reaktionsproduktes betrug dabei > 98%. H. polymorpha Katalysatoren zeigten für die Synthese eine höhere Effizienz als A. adeninivorans Zellen. Die erstgenannten waren in der Lage 93% vom Ethylbenzoylformiat innerhalb von 180 min zu konvertieren, während letztere 94% des Substrates innerhalb von 360 min umwandelten. Durch Einschlussimmobilisierung der Biokatalysatoren in Lentikats® wurde eine Verbesserung der Stabilität und damit eine erhöhte Wiederverwendungshäufigkeit erreicht. Die erreichten Raumzeitausbeuten betrugen 3.07 mmol l-1h-1 und 6.07 mmol l-1h-1 mit A. adeninivorans bzw. H. polymorpha als Ganzzellkatalysatoren. Abschließend wurde eine Alkoholdehydrogenase von A. adeninivorans charakterisiert. Basierend auf der Homologie mit der Alkohol-Dehydrogenase 1 von S. cerevisiae wurde dazu das AADH1 Gen ausgewählt, isoliert und in A. adeninivorans überexprimiert.

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Metadaten
Author: Jakub Kasprzak
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002689-2
Title Additional (English):Alcohol dehydrogenases as biocatalysts for the production of enantiomerically pure chiral alcohols
Title Additional (German):Alkoholdehydrogenasen als Biokatalysatoren zur Herstellung von enantiomerenreinen chiralen Alkoholen
Advisor:Prof. Dr. Frieder Schauer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2017/01/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/12/21
Release Date:2017/01/11
GND Keyword:Alcohol dehydrogenases, Arxula adeninivorans, Chiral alcohols, Hansenula polymorpha, Yeast
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie