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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002876-3

In vivo Beobachtung von Podozyten in der Zebrafischlarve mit der 2-Photonenmikroskopie

  • Podozyten, die hochspezialisierten viszeralen Epithelzellen des Glomerulus, bedecken die Außenseite der glomerulären Kapillaren und sind für die Filtration des Blutes in der Niere essentiell. Eine Schädigung der Podozyten geht mit dem Verlust ihrer komplexen dreidimensionalen Struktur, dem sogenannten Fußfortsatz-Effacement einher. Effacement und Detachment, das Ablösen der Podozyten von der glomerulären Basalmembran, führen zur Ausscheidung von hochmolekularen Proteinen mit dem Urin und in vielen Fällen zu einer nicht heilbaren chronischen Nierenerkrankung (CKD). In der Vergangenheit wurde anhand von Zellkulturstudien und Versuchen an Ratten und Mäusen die These aufgestellt, dass Podozyten entlang der glomerulären Basalmembran wandern können. Da diese Experimente jedoch bisher nicht eindeutig belegen konnten, dass es sich bei den beobachteten Zellen tatsächlich um vollständig differenzierte Podozyten handelte und diese Fragestellung für das Verständnis der Pathogenese chronischer Nierenerkrankungen und damit für die Entwicklung neuer Therapieverfahren von wesentlicher Bedeutung ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Verfahren entwickelt, Fluoreszenz-markierte Podozyten in vivo in lebenden Zebrafischlarven zu beobachten. Dazu wurde zunächst durch Kreuzung ein transgener Zebrafischstamm generiert, dessen Larven vollständig transparent sind und das grün-fluoreszierende Protein unter Kontrolle des wt1a-Promoters in Podozyten exprimieren. Mit der 2-Photonenmikroskopie konnten nun in Langzeitaufnahmen einzelne Podozyten in fünf bis sechs Tage alten Zebrafischlarven beobachtet werden. Hierbei zeigte sich eindeutig, dass Podozyten über Zeiträume von bis zu 23 Stunden nicht wandern. Da mit dieser Technik auch einzelne Primärfortsätze der Podozyten beobachtet werden können, konnte erstmals gezeigt werden, dass sich auch diese nicht signifikant innerhalb eines Beobachtungszeitraums von bis zu 23 Stunden bewegten. Als Nachweis, dass mit dieser Beobachtungsmethode dynamische Podozyten nachgewiesen werden können, wurde die Bewegung einzelner Zellen während der Bildung des Glomerulus über einen Zeitraum von 3 Tagen verfolgt. Um ferner auszuschließen, dass Podozytenfortsätze sehr schnelle, oszillierende Bewegungen vollführen, wurden einzelne Podozyten in sehr kurzen Intervallen aufgenommen und das Bewegungsmuster analysiert. Auch hier zeigten sich keine dynamischen Eigenschaften der Podozyten im lebenden Organismus. Somit kann davon ausgegangen werden, dass Podozyten unter physiologischen Bedingungen in lebenden Zebrafischlarven kein dynamisches Verhalten zeigen, sondern als statische Zellen anzusehen sind.
  • Podocytes, the highly specialized and postmitotic visceral epithelial cells of the glomerulus, cover the outer aspect of the glomerular capillaries and are essential for the filtration of the blood in the kidney. A damage of podocytes is associated with the loss of their complex three-dimensional architecture, the so-called foot process effacement. Effacement and detachment, the loss of podocytes from the glomerular basement membrane lead to the excretion of high molecular weight proteins with the urine and in many cases to non-curable chronic kidney diseases (CKD). In the past, the hypothesis arose whether podocytes might be able to migrate along the glomerular basement membrane. Since this question is of fundamental importance for the understanding of the pathogenesis of chronic kidney diseases and thus for the development of new therapeutic approaches, we developed a method to study fluorescent-labeled podocytes in vivo in living zebrafish larvae over time. For this purpose, a transgenic zebrafish line was generated whose larvae were completely transparent and expressed the green fluorescent protein under the control of the wt1a promoter in podocytes. With the two-photon microscopy single podocytes could now be visualized in long-term recordings in five to six day old zebrafish larvae. Our observations demonstrated that podocytes neither migrated nor changed their branching pattern of major processes over a time period of up to 23 hours. As proof that with this observation protocol dynamic podocytes could be detected, the movement of individual cells was assessed over a period of time of 3 days during the formation of the glomerulus. Furthermore, in order to rule out that podocyte extensions show very fast oscillating movements, single podocytes were recorded in very short intervals and the motion pattern were analyzed. Again, no dynamic properties of the podocytes were found in the living organism. Thus, it can be assumed that podocytes show no dynamic behavior, but reveals as static cells under physiological conditions in living zebrafish larvae.

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Metadaten
Author: Ole Simon
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002876-3
Title Additional (English):In vivo visualization of podocytes in zebrafish larvae by two-photon microscopy
Advisor:Prof. Dr. Nicole Endlich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2017/09/21
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/08/29
Release Date:2017/09/21
GND Keyword:Cytologie, Intravitalmikroskopie, Mikroskopie, Podozyte, Zebrafisch
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Anatomie und Zellbiologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit