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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002543-4

Untersuchung zur Prävalenz und DNA-Microarray-basierende Typisierung von Clostridium difficile bei Heim- und Nutztieren

  • Clostridium (C.) difficile ist beim Menschen ein bedeutender Erreger von Krankenhaus-assoziierten Durchfallerkrankungen. Die vorliegende Dissertation umfasst die Erhebung und Analyse der ersten epidemiologischen Daten zu C. difficile in deutschen Heim- und Nutztierbeständen und die Entwicklung eines neuartigen DNA-Microarrays, der eine einfache Ribotypisierung von C. difficile ermöglicht. In drei Studien wurden Kotproben von Hunden, Katzen, Ferkeln und Kälbern kulturell auf C. difficile untersucht. Das Bakterium wurde aus 5 von 135 Katzenkot- (3,7%), 9 von 165 Hundekot- (5,4%), 176 von 999 Kälberkot- (17,6%) und 147 von 201 Schweinekotproben (73,1%) isoliert. Neugeborene Ferkel und Kälber waren in den ersten 2 bzw. 3 Lebenswochen signifikant häufiger kulturpositiv für C. difficile als ältere Tiere. Die in den Studien isolierten Stämme wurden 25 Ribotypen zugeordnet; darunter befanden sich 6 bisher nicht beschriebene Varianten. Bei den Ferkelproben dominierten die einander sehr ähnlichen Ribotypen 078 (55% der Isolate) und 126 (20%). Die Ribotypen 033 (57% der Isolate) und 078 (17%) wurden bei Kälbern am häufigsten vorgefunden. Basierend auf ihren Typisierungsprofilen wurden die Ribotypen in einer UPGMA-Analyse (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) untereinander verglichen. Von den 25 bei den untersuchten Tieren gefundenen Ribotypen formten 11 einen Cluster, zu dem auch die Ribotypen 033, 078 und 126 gehörten und in dem sich 90% aller in den beiden Nutztierstudien isolierten Stämme wiederfanden. Alle Isolate dieses Clusters waren zudem PCR-positiv für ein binäres Toxin und, im Gegensatz zu allen nicht zu dem Cluster gehörenden Ribotypen, PCR-negativ für den MLVA-Lokus A6Cd. Hierdurch, aber auch durch frühere Studien, in denen gezeigt werden konnte, dass die dem Cluster zugeordneten Ribotypen 033, 045, 078 und 126 den gleichen MLST-Typ (ST-11, Multilocus Sequence Typing) und eine charakteristische Deletion (delta 39 bp) im Toxinregulatorgen tcdC aufweisen, wird die These einer genetische Verwandtschaft unterstützt. In allen untersuchten Tierpopulationen wurden Ribotypen gefunden, die mit C.-difficile-Infektionen des Menschen assoziiert werden. Da Stämme des Ribotyps 078 in deutschen und europäischen Krankenhäusern zunehmend häufiger als Ursache von Durchfallerkrankungen auftreten, wurden alle ermittelten MLVA-Daten von Ribotyp-078-Stämmen humanen und tierischen Ursprungs mit entsprechenden Daten anderer Studien aus 5 europäischen Ländern verglichen. In einer hierbei durchgeführten Minimum-Spanning-Tree-Analyse mit 294 Datensätzen wurde die genetische Abgrenzung von MLVA-Typen unterschiedlicher geographischer Herkunft verdeutlicht und belegt, dass einige aus Tieren und Menschen isolierte C.-difficile-Stämme sehr ähnlichen oder sogar identischen MLVA-Typen entsprechen. Die in den Haus- und Nutztierstudien isolierten C. difficile wurden anschließend mit dem neu entwickelten DNA-Microarray ribotypisiert. Das Sondendesign des Microarrays basiert auf der bei C. difficile modular aufgebauten Intergenic Spacer Region (ISR), welche auch Zielstruktur der herkömmlichen Ribotypisierungsmethoden ist. Die Sonden wurden von in der GenBank-Datenbank publizierten ISR-Modulsequenzen und theoretisch möglichen Modulsequenzkombinationen abgeleitet. Nachdem die Eignung des Arrays in theoretisch und praktisch durchgeführten Experimenten belegt werden konnte, wurde mit 142 repräsentativ ausgewählten C.-difficile-Stämmen eine 48 Ribotypen umfassende Datenbank aus Referenzhybridisierungsmustern erstellt. Diese Referenzmuster wurden anschließend in einer Ähnlichkeitsmatrix-Analyse untereinander verglichen, wobei 27 Referenzmuster eindeutig differenziert werden konnten. Zu den gut unterscheidbaren Ribotypen gehörten u.a. die häufig mit humanen C.-difficile-Infektionen assoziierten Ribotypen 001, 014/020, 027 und 078/126. Nicht unterscheidbar hingegen waren die 11 Ribotypen des oben beschriebenen Clusters, wodurch sich die These ihrer molekularen Verwandtschaft weiter erhärtet. Die Praxistauglichkeit des DNA-Microarrays wurde abschließend in einer Anwendungsstudie überprüft. Hierbei wurden 50 C.-difficile-Stämme, die im Rahmen eines anderen Projektes aus Kotproben von Haustieren und deren Besitzern isoliert wurden, mit herkömmlicher und DNA-Microarray-basierter Ribotypisierung vergleichend untersucht. Berücksichtig man, dass durch den Microarray einige sehr ähnliche Ribotypen derzeit noch nicht unterschieden werden können, wurden alle Isolate dem richtigen Ribotypen bzw. der richtigen Ribotypengruppe zugeordnet. Darüber hinaus wurden 6 für das Microarray unbekannte Ribotypen korrekt als „neu“ und klar voneinander unterscheidbar erkannt. Zusammenfassend trägt das Dissertationsprojekt zum Verständnis über das Vorkommen von C.-difficile-Genotypen in Heim- und Nutztierbeständen bei und präsentiert einen neuartigen DNA-Microarray zur einfachen Ribotypisierung von C. difficile.
  • Clostridium (C.) difficile is the leading infectious agent of nosocomial diarrhea in humans. This dissertation comprises studies on the presence and diversity of C. difficile in German farm and companion animals and describes the development of a DNA microarray based assay for efficient and reliable PCR ribotyping of C. difficile strains on a convenient laboratory platform. In three studies, faecal samples from dogs, cats, piglets and calves were examined using direct plating and enrichment culture in parallel. C. difficile isolated in these studies were characterized by toxin gene PCR (tcdA, tcdB, cdtA, and cdtB), multiple-locus VNTR analysis (MLVA), capillary gel electrophoresis-based PCR ribotyping (seq-PCR ribotyping) and by the new DNA microarray assay. C. difficile was isolated from 5 of 135 (3.7%) feline, 9 of 165 (5.4%) canine, 176 of 999 (17.6%) bovine and 147 of 201 (73.1%) porcine samples. The prevalence’s found for piglets and calves of 4 weeks of age and older were significantly lower than for younger animals. Strains isolated in these studies were assigned to 25 PCR ribotypes, including 6 PCR ribotypes that have not been previously described. The closely related PCR ribotypes 078 (55%) and 126 (20%) were most frequently found in porcine samples while PCR ribotypes 033 (57%) and 078 (17%) were predominant in the calve samples. Strains of PCR ribotypes, previously described to be human pathogenic (e.g. 014, 078, 126, and 023) were found in all investigated species. Neighbourhood analysis (UPGMA, Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) based on the PCR ribotype peak pattern revealed a clusters with 11 related PCR ribotypes that differed significantly from the other detected PCR ribotypes. This cluster comprised i. a. PCR ribotypes 033, 045, 078 and 126 and accounted for 90% of all C. difficile strains isolated from farm animals. Molecular relatedness was supported by the absence of the MLVA locus A6Cd only in clustered strains and identical toxin gene profiles. Previously reported multilocus sequence typing analysis found an identical sequence type (ST-11) and a tcdC deletion (delta 39 bp) for PCR ribotypes 033, 045, 078 and 126, confirming the clustering. PCR ribotype 078 is increasingly being recognized as a cause of human infections. Therefore, data for isolates of this ribotype recovered during the dissertation (including isolates of human CDI patients) were compared to previous published MLVA data, including porcine, human, and bovine C. difficile isolates from 5 European countries. The calculated minimum spanning tree of 294 European C. difficile isolates of PCR ribotype 078 revealed genetic differences between strains of European countries and also confirmed that some human and porcine isolates are genetically closely related. C. difficile strains isolated in the livestock and shelter studies were subsequently PCR ribotyped using the developed DNA microarray assay. Hybridization probes were designed to query the modularly structured intergenic spacer region (ISR), which is also the template for conventional and PCR ribotyping with subsequent capillary gel electrophoresis (seq-PCR) ribotyping. The probes were derived from sequences available in GenBank as well as from theoretical ISR module combinations. A database of reference hybridization patterns was set up from a collection of 142 well-characterized C. difficile isolates representing 48 seq-PCR ribotypes. The reference hybridization patterns calculated by the arithmetic mean were compared using a similarity matrix analysis. The 48 investigated seq-PCR ribotypes revealed 27 array profiles that were clearly distinguishable. The most frequent human-pathogenic ribotypes 001, 014/020, 027, and 078/126 were discriminated by the microarray. C. difficile strains related to 078/126 (033, 045/FLI01, 078, 126, 126/FLI01, 413, 413/FLI01, 598, 620, 652, and 660) and 014/020 (014, 020, and 449) showed similar hybridization patterns, confirming their genetic relatedness, which was reported in the prevalence studies. A panel of 50 C. difficile field isolates was tested by seq-PCR ribotyping and the DNA microarray-based assay in parallel. Taking into account that the current version of the microarray does not discriminate some closely related seq-PCR ribotypes, all isolates were typed correctly. Moreover, seq-PCR ribotypes without reference profiles available in the database (ribotype 009 and 5 new types) were correctly recognized as new ribotypes, confirming the performance and expansion potential of the microarray. In summary, the dissertation showed that German farm and companion animals are potential reservoirs of emerging human pathogenic C. difficile PCR ribotypes and presented the first DNA microarray-based assay for rapid PCR ribotyping of C. difficile.

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Metadaten
Author: Alexander Schneeberg
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002543-4
Title Additional (English):Studies on prevalence and DNA microarray-based typing of Clostridium difficile isolated from farm and companion animals
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/05/31
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/05/20
Release Date:2016/05/31
Tag:MLVA, Ribotypisierung
MLVA, Ribotyping
GND Keyword:Clostridium difficile, Ferkel, Genotyp, Heimtiere, Hund, Kalb, Katze, Microarray, Molekularbiologie, Nutztiere, Zoonose
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie