Open Access

Pauline Dianne Santos

• Infectious diseases remain a significant threat to the wellbeing of humans and animals worldwide. Thus, infectious disease outbreaks should be investigated to understand the emergence of these pathogens, leading to prevention and mitigation strategies for future outbreaks. High-throughput sequencing (HTS) and bioinformatic analysis tools are reshaping the surveillance of viral infectious diseases through genome-based outbreak investigations. In particular, analyzing generic HTS datasets using a metagenomic analysis pipeline enable simultaneous identification, characterization, and discovery of pathogens. In this thesis, generic HTS datasets derived from the 2018-19 WNV epidemic and USUV epizooty in Germany were evaluated using a unified pipeline for outbreak investigation and an early warning system (EWS). This pipeline obtained 34 West Nile virus (WNV) whole-genome sequences and detected several sequences of Usutu virus (USUV) and other potential pathogens. A few WNV and USUV genome sequences were completed using targeted HTS approaches. Phylogenetic and phylogeographic inferences, reconstructed using WNV wholegenome sequences, revealed that Germany experienced at least six WNV introduction events. The majority of WNV German variants clustered into the so-called “Eastern German clade (EGC),” consisting of variants derived from birds, mosquitoes, a horse, and human cases. The progenitors of the EGC subclade probably circulated within Eastern Europe around 2011. These flavivirus genome sequences also provided substantial evidence for the first reported cases of WNV and USUV co-infection in birds. Phylogenetic inferences of USUV genome sequences showed the further spread of the USUV lineage Africa 3 and might indicate the overwintering of the USUV lineage Europe 2 in Germany. Among viral sequences reported in the EWS, Hedwig virus (HEDV; a novel peribunyavirus) and Umatilla virus (UMAV; detected in Europe for the first time) were investigated using genome characterization, molecular-based screening, and virus cultivation since these viruses were suspected of causing co-infections in WNV-infected birds. The EWS detected overall 8 HEDV-positive and 15 UMAV-positive birds in small sets of samples, and UMAV could be propagated in a mosquito cell culture Future studies are necessary to investigate the pathogenicity of these viruses and their role in the health of wild and captive birds. In conclusion, this study provided a proof-of-concept that the developed unified and generic pipeline is an effective tool for outbreak investigation and pathogen discovery using the same generic HTS datasets derived from outbreak and surveillance samples. Therefore, this thesis recommends incorporating the unified pipeline in the key response to viral outbreaks to enhance outbreak preparedness and response.
• Infektionskrankheiten stellen nach wie vor eine erhebliche Bedrohung für das Wohlergehen von Menschen und Tieren weltweit dar. Daher sollten Ausbrüche von Infektionskrankheiten untersucht werden, um die Entstehung dieser Erreger zu verstehen und Präventions- sowie Eindämmungsstrategien für künftige Ausbrüche entwickeln zu können. Die Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS) und bioinformatische Analysetools verändern die Überwachung viraler Infektionskrankheiten durch genombasierte Ausbruchsuntersuchungen. Insbesondere die Analyse von generischen HTS-Datensätzen mit Hilfe einer metagenomischen Analysepipeline ermöglicht die gleichzeitige Identifizierung, Charakterisierung und Entdeckung von Pathogenen. In dieser Arbeit wurden generische HTS-Datensätze, die von der WNV-Epidemie 2018- 19 und der USUV-Epizootie in Deutschland stammen, mit einer einheitlichen Pipeline für die Ausbruchsuntersuchung und einem Frühwarnsystem (EWS) ausgewertet. Diese Pipeline lieferte 34 Ganzgenomsequenzen des West-Nil-Virus (WNV) und wies mehrere Sequenzen des Usutu-Virus (USUV) und anderer potenzieller Erreger nach. Einige WNV- und USUVGenomsequenzen wurden durch gezielte HTS-Ansätze vervollständigt. Phylogenetische und phylogeographische Schlussfolgerungen, die anhand von WNV-Ganzgenomsequenzen rekonstruiert wurden, ergaben, dass es in Deutschland mindestens sechs WNVEinschleppungsereignisse gab. Die Mehrzahl der deutschen WNV-Varianten stammt von Fällen bei Vögeln, Stechmücken, einem Pferd und Menschen und wurde in der so genannten "Eastern German Clade" (EGC) zusammengefasst. Die Vorläufer der EGC-Subklade zirkulierten wahrscheinlich um 2011 in Osteuropa. Diese Flavivirus-Genomsequenzen lieferten auch wesentliche Beweise für die ersten gemeldeten Fälle von WNV- und USUV-Koinfektionen bei Vögeln. Phylogenetische Rückschlüsse aus den USUV-Genomsequenzen zeigten die weitere Verbreitung der USUV-Linie Afrika 3 und könnten auf die Überwinterung der USUV-Linie Europa 2 in Deutschland hinweisen. Von den im EWS gemeldeten Virensequenzen wurden das Hedwig-Virus (HEDV; ein neuentdecktes Peribunyavirus) und das Umatilla-Virus (UMAV; zum ersten Mal in Europa entdeckt) mittels Genomcharakterisierung, molekularbasiertem Screening und Viruskultivierung untersucht, da diese Viren im Verdacht standen, CoInfektionen bei WNV-infizierten Vögeln zu verursachen. Das EWS wies insgesamt 8 HEDVpositive sowie 15 UMAV-positive Vögel in kleinen Probensätzen nach außerdem konnte UMAV in einer Stechmücken-Zellkultur vermehrt werden. Es sind zukünftig weitere Studien notwendig, um die Pathogenität dieser Viren und ihre Rolle für die Gesundheit von Wildvögeln und in Gefangenschaft gehaltenen Vögeln zu untersuchen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie den Nachweis erbracht hat, dass die entwickelte einheitliche und generische Pipeline ein wirksames Instrument für die Untersuchung von Ausbrüchen und die Entdeckung von Krankheitserregern ist, wobei dieselben generischen HTS-Datensätze verwendet werden, die aus Ausbruchs- und Überwachungsproben stammen. Daher wird in dieser Arbeit empfohlen, die einheitliche Pipeline in die zentrale Reaktion auf Virusausbrüche einzubeziehen, um die Bereitschaft und Reaktion auf Ausbrüche zu verbessern.